姜倩倩，曹 慧

（濰坊學(xué)院，山東 濰坊 261061）

流式細(xì)胞術(shù)在高等植物細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用＊

姜倩倩，曹 慧

（濰坊學(xué)院，山東 濰坊 261061）

流式細(xì)胞術(shù)作為一種快速、靈敏的細(xì)胞分析技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞動力學(xué)、分子生物學(xué)等植物學(xué)研究的多個領(lǐng)域。本文簡要論述了流式細(xì)胞儀的工作原理，并對其在高等植物細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用做了綜述。

流式細(xì)胞術(shù)；細(xì)胞核；染色體；細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer）是一項(xiàng)集激光技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)、電子物理、流體力學(xué)、細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。它的研制、發(fā)展、革新和應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)展是由生物學(xué)、生物技術(shù)、計算機(jī)科學(xué)、電子工程學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、分子生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)和物理學(xué)等多個學(xué)科綜合發(fā)展和應(yīng)用而實(shí)現(xiàn)的［1］。流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細(xì)胞儀對生物顆粒（細(xì)胞、細(xì)胞器、微生物）的多種物理和生物學(xué)特性進(jìn)行定量分析，并可根據(jù)測量的參數(shù)，同時將測量群體中的一個或兩個亞群加以分選的細(xì)胞分析測量技術(shù)，具有操作簡單、分析精確、重復(fù)性好、費(fèi)用低廉、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。

FCM在醫(yī)學(xué)臨床方面的應(yīng)用較為廣泛，如腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)及臨床檢驗(yàn)等，并拓展到生物學(xué)的各個領(lǐng)域，如細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、微生物學(xué)，分子免役學(xué)，生物化學(xué)等。FCM在植物中尤其是高等植物中的應(yīng)用較晚，直到20世紀(jì)80年代中期才開始，主要是適合流式細(xì)胞分析的植物單細(xì)胞懸液制備比較困難。FCM要求所提供的樣本必須是完整的細(xì)胞或細(xì)胞核的懸浮液，由于植物細(xì)胞不同于動物細(xì)胞，除了具有細(xì)胞壁外，植物細(xì)胞中還含有大量次生代謝物，這就給制備樣本增加了難度，大大降低了流式實(shí)驗(yàn)的成功率。自從Dolezel等［2］發(fā)現(xiàn)利用植物根尖分裂組織或者幼嫩葉片較易獲得合適的單細(xì)胞懸液后，F(xiàn)CM在植物學(xué)研究方面得到了廣泛應(yīng)用，其中細(xì)胞核DNA分析、倍性分析、染色體結(jié)構(gòu)分析、細(xì)胞周期分析等方面是其應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域。

1 流式細(xì)胞儀的工作原理

待測細(xì)胞被制備成單個細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料標(biāo)記后，在氣體壓力下，以一定速度進(jìn)入流動室。流動室內(nèi)充滿了同軸方向流動的鞘液，樣品在鞘液的約束下，細(xì)胞呈單個排列形成液柱以均等的時間依次通過流動室的噴嘴，然后從噴嘴噴出進(jìn)入檢測區(qū)。液柱與入射的激光束垂直相交，相交點(diǎn)稱為測量區(qū)。通過測量區(qū)的細(xì)胞在激光的照射下產(chǎn)生散射光和熒光，分別由聚光系統(tǒng)中的不同濾光片收集并送到檢測器上。用于FCM的檢測器主要有硅光電二極管和光電倍增管。硅光電二極管適合于強(qiáng)光的檢測，常用于前向角散射光（FSC）的測量。光電倍增管適合于弱光的檢測，常用于熒光及側(cè)向角散射光（SSC）的檢測。檢測器將進(jìn)入的光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柡螅?jīng)模擬數(shù)字（A／V）轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為數(shù)據(jù)，經(jīng)計算機(jī)分析后，細(xì)胞的一系列重要物理化學(xué)特性就被快速、大量地測定出來［3－4］。

此外，流式細(xì)胞儀還可以對分析中的目的細(xì)胞進(jìn)行分選提取，它是通過分離含有單細(xì)胞的液滴而實(shí)現(xiàn)的。在流動室的噴嘴上安裝有超高頻的壓電晶體，可以產(chǎn)生高頻振蕩，產(chǎn)生同頻機(jī)械振動，流動室也隨之振動，因此液流斷裂為均勻的液滴，其形成速度與振動頻率有關(guān)，待測細(xì)胞就包含在液滴之中。將這些液滴充上正或負(fù)電荷，當(dāng)帶電液滴通過電場，在電場的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)，然后落入相應(yīng)的收集器之中，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選。

2 流式細(xì)胞儀在植物細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用

2.1 識別和分揀植物染色體

1984年，De Laat和Blass［5］第一次報道了流式細(xì)胞技術(shù)識別和分揀植物染色體。他們制備了模式植物纖細(xì)單冠菊的完整染色體懸浮液，通過流式細(xì)胞術(shù)分離了2種染色體類型。隨后，流式細(xì)胞技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物染色體研究中，目前已對數(shù)十種植物種類進(jìn)行了染色體分析，其中豆類及禾谷類作物應(yīng)用最多。

識別和分揀染色體的流式細(xì)胞儀是專門帶有分揀設(shè)備的流式細(xì)胞儀，也叫熒光激活流式細(xì)胞分揀儀，分析的樣品是染色體懸浮液，分離和分選的對象是中期染色體或染色體的部分，是亞細(xì)胞水平的技術(shù)操作。其原理是有絲分裂中期細(xì)胞去細(xì)胞壁后制成特異性熒光染色的染色體懸浮液，作為樣品加入到流式細(xì)胞儀并形成狹窄的液流按一定順序高速通過光學(xué)檢測系統(tǒng)的高強(qiáng)度光束，已染色的染色體產(chǎn)生的熒光被量化，進(jìn)而根據(jù)染色體大小、形態(tài)和相對熒光強(qiáng)度對染色體進(jìn)行分類分析。通過把高速液流截斷成液滴，帶電荷的含有所需染色體的液滴經(jīng)過靜電場會偏離液流，從而分離和純化單個染色體［6］。傳統(tǒng)的熒光染色方法是用1－2種DNA熒光染料對染色體懸浮液進(jìn)行染色，相對的熒光強(qiáng)度分布分別以單參數(shù)和雙參數(shù)流式核型顯示［7］。理想的話，每個染色體應(yīng)以較分散的峰面被區(qū)別出來。但實(shí)際分揀時，由于許多種植物的染色體大小差異較小，只能在其流式核型分析圖中形成一個復(fù)合峰，若僅通過流式分揀，尚不能達(dá)到分揀單條染色體的水平。此外，由于植物染色體懸浮液濃度低，染色體篩選的速度受到嚴(yán)重影響。因此，制備好的染色體懸浮液是應(yīng)用流式分析的關(guān)鍵。

被FCM分選出來的植物染色體可被篩選到尼龍濾紙、顯微鏡玻片、PCR試管或其他試管。單條染色體分揀能將基因組化整為零，克服了基因組過大難以分析的困難，提高特定染色體片段和特定基因分離和研究的效率；另外在克隆之前，通過分割基因組可以大大減少文庫篩選；分揀的染色體的形態(tài)可以得到良好的保持，具有廣泛的應(yīng)用范圍和廣闊的發(fā)展前景。其中，就可應(yīng)用FCM分選出活的原生質(zhì)體，并通過分選出來的原生質(zhì)體再生出植株，其中最有意義的就是選出由原生質(zhì)體融合所產(chǎn)生的異核體。劉繼紅等［8］采用流式細(xì)胞術(shù)，對酸橙（Citrus aurantium L）葉肉原生質(zhì)體和甜橙（C sineniscv Shamouti）胚性愈傷組織原生質(zhì)體電融合后再生的體細(xì)胞雜種進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有的體細(xì)胞雜種植株熒光強(qiáng)度是二倍體對照的兩倍，這說明兩者的原生質(zhì)體已經(jīng)融合?？梢苑诌x出來用于新品種的培育。

2.2 測定植物細(xì)胞核DNA含量

1983年，Galbraith運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)成功測定了17種植物的核DNA含量，為運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測植物核DNA含量的研究開創(chuàng)了先河。DNA與其熒光染料如PI（碘化丙啶）、EB（溴化乙啶）、HO33342、HO33258、DAPI（4’6－二脒基二苯基吲哚）和AO（吖啶橙）等定量結(jié)合后，經(jīng)激光照射發(fā)出特異熒光。在同一條件下，經(jīng)熒光試劑處理的細(xì)胞核內(nèi)DNA分子數(shù)目越多，這些DNA促發(fā)熒光的強(qiáng)度也就越強(qiáng)，直接反映細(xì)胞核DNA含量的高低。

理論上，在細(xì)胞分裂時，隨著染色體數(shù)目的成倍增加，細(xì)胞核DNA含量成倍增加，檢測到的熒光強(qiáng)度也必然成倍增加。細(xì)胞核DNA相對含量的高低與細(xì)胞的倍性密切相關(guān)，根據(jù)細(xì)胞核DNA含量的高低可進(jìn)行倍性鑒定。倍性鑒定的方法一直是多倍體研究的重要內(nèi)容之一，染色體計數(shù)法雖然準(zhǔn)確性高，但操作復(fù)雜，用于大量材料的倍性鑒定仍相當(dāng)困難，而利用細(xì)胞學(xué)特征進(jìn)行倍性鑒定雖然易于進(jìn)行，但鑒定的準(zhǔn)確性有待于提高。近年來，F(xiàn)CM開始用于植物細(xì)胞核DNA含量的研究，目前已對柑橘［9］、葡萄［10］、大白菜［11］及菊花［12］等進(jìn)行過研究。這些研究表明，利用FCM測定細(xì)胞核DNA的相對含量是一條快速方便，且準(zhǔn)確性高的鑒定植物染色體倍性的途徑。

用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析時，常用DNA的絕對含量或相對含量來進(jìn)行分析。如果要測量DNA的絕對含量，就必須設(shè)一個標(biāo)準(zhǔn)的樣品，來換算出DNA的絕對含量。通常用已知細(xì)胞核DNA含量的雞血紅細(xì)胞核作測量標(biāo)準(zhǔn)。付改蘭和馮玉龍［13］利用流式細(xì)胞儀鑒定多種雜草倍性時，就是以已知細(xì)胞核DNA含量的雞血紅細(xì)胞核作測量標(biāo)準(zhǔn)。測定DNA的相對含量時，選擇一個已知倍性的同類材料作對照，所有待檢測的樣品均與其作比較，即可換算出待檢樣品的DNA相對含量，并對其進(jìn)行倍性分析。2005年日本Kulthinee等［14］用已知DNA含量的大麥品種做對照，使用流式細(xì)胞儀鑒定多種獼猴桃品種的倍性。

2.3 分析植物細(xì)胞周期

應(yīng)用FCM計算測量植物細(xì)胞核內(nèi)DNA含量以及鑒定染色體倍性實(shí)際上是細(xì)胞周期的測量。流式細(xì)胞儀對單個細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行分析時，通過標(biāo)記物發(fā)出熒光的強(qiáng)弱可推算出G0、G1期（二倍體）、S期（超二倍體）、G2、M期（四倍體）的比例，其結(jié)果以DNA分布的直方圖的形式顯示，進(jìn)而可由G0／G1，S／G2＋M比率來了解細(xì)胞的增殖能力，并可了解細(xì)胞的增殖狀態(tài)。［15］

2.4 檢測植物凋亡細(xì)胞

細(xì)胞凋亡（Apoptosis），又稱細(xì)胞程序性死亡，是由基因控制的細(xì)胞自主性的有序的死亡過程，是生物體生長發(fā)育過程中出現(xiàn)的正?，F(xiàn)象，在生物體形態(tài)構(gòu)成、正常細(xì)胞更替以及維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等過程中發(fā)揮重要作用。FCM檢測凋亡細(xì)胞的方法包括三個方面。

2.4.1 形態(tài)學(xué)檢測

在FCM檢測時，前向散射光（FSC）的強(qiáng)度與細(xì)胞大小有關(guān)，而側(cè)向散射光（SSC）的強(qiáng)度與質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部的折射率有關(guān)。細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞膜皺縮，胞漿濃縮，體積變小，細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多，所以凋亡細(xì)胞的典型特征是前向角散射下降和側(cè)向角散射升高。［16］

2.4.2 細(xì)胞DNA含量的檢測

在凋亡細(xì)胞內(nèi)，由于細(xì)胞核的解聚和凋亡小體的形成，核內(nèi)的總DNA含量下降，利用FCM檢測細(xì)胞的DNA含量可以形成直方圖，如果在直方圖上二倍體細(xì)胞峰的左方出現(xiàn)亞二倍體峰，即凋亡峰就說明存在細(xì)胞凋亡，并且通過測定凋亡峰的高度可以確定凋亡細(xì)胞的比例。［17］

2.4.3 DNA斷裂點(diǎn)標(biāo)記法

細(xì)胞凋亡的最后階段是形成DNA片段，DNA斷裂點(diǎn)法檢測的即是DNA的斷裂片段，即標(biāo)記DNA斷裂的3′－羥基末端，常采用由DNA聚合酶I催化的原位缺口轉(zhuǎn)移（in situ nick translation，ISNT）或用Td T介導(dǎo)的d UTP原位缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated d UTP nick end labeling，TUNEL）技術(shù)，兩者均可進(jìn)行間接或直接標(biāo)記。間接標(biāo)記物常為生物素化脫氧三磷酸尿苷（biotin－d UTP）或地高辛配體（Dig）－d UTP等，此外還需要連霉親和素或抗Dig－d UTP，使標(biāo)記反應(yīng)增倍，提高靈敏度；直接標(biāo)記的標(biāo)記物常為異硫氰酸熒光素（FITC）－d UTP。［18－19］

3 結(jié)束語

近年來，F(xiàn)CM作為一種日漸成熟的技術(shù)，已經(jīng)深入到植物研究的諸多領(lǐng)域，給工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究提供了一個強(qiáng)有力的工具。目前，利用FCM不但可以對植物細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)、測量基因組大小，還能分析細(xì)胞周期、鑒定核型（染色體的DNA含量）、分揀染色體以及構(gòu)建染色體文庫等。FCM作為一種生物檢測技術(shù)已經(jīng)日臻完善，儀器的硬件平臺也已達(dá)到穩(wěn)定的技術(shù)狀態(tài)。但是，這種技術(shù)還有一些自身的缺點(diǎn)，如價格昂貴、對操作人員要求高以及樣品需要復(fù)雜的前處理等，這都限制了流式細(xì)胞術(shù)在植物領(lǐng)域中的應(yīng)用?？茖W(xué)家和儀器制造商又紛紛將研究的焦點(diǎn)轉(zhuǎn)向熒光染料的開發(fā)、單克隆抗體技術(shù)、細(xì)胞的制備方法以及提高電子信號的處理能力上來，以拓展FCM日趨廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。我們相信流式細(xì)胞術(shù)作為一種不斷完善的技術(shù)在植物學(xué)研究中將有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：肖恩忠）

Applications of Flow Cytometry in the Study of Higher Plant Cytology

JIANG Qian－qian，CAO Hui
（Weifang University，Weifang 261061，China）

In this paper，the foundational characteristics of the flow cytometry were briefly described，and its applications in the study of higher plant cytology，including cell nuclei，protoplast，chromosome，and cell apoptosis were elaborated.

flow cytometry，cell nuclei，chromosome，cell apoptosis

2011－07－24

姜倩倩（1983－），女，山東泰安人，濰坊學(xué)院生物工程學(xué)院講師，博士。研究方向：果樹生理與分子生物學(xué)。

S601 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671－4288（2011）06－0082－04