周新改， 馬偉華＊， 劉美剛， 楊小紅， 王 沫

（1.湖北省昆蟲(chóng)資源利用與害蟲(chóng)可持續(xù)治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070；2.湖北省仙桃市植物保護(hù)站，仙桃 433000； 3.湖北省潛江市植物保護(hù)站，潛江 433104）

湖北省棉花主產(chǎn)區(qū)煙粉虱生物型分布及系統(tǒng)發(fā)育分析

周新改1， 馬偉華1＊， 劉美剛2， 楊小紅3， 王 沫1

（1.湖北省昆蟲(chóng)資源利用與害蟲(chóng)可持續(xù)治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070；2.湖北省仙桃市植物保護(hù)站，仙桃 433000； 3.湖北省潛江市植物保護(hù)站，潛江 433104）

［目的］明確武漢、荊州、孝感、隨州、武穴5個(gè)棉花主產(chǎn)區(qū)煙粉虱生物型組成。［方法］通過(guò)以線粒體細(xì)胞色素氧化酶I（mitochondrial cytochrome oxidase I，mtCOI）為基礎(chǔ)的PCR-RFLP和基因測(cè)序的方法，鑒定湖北5個(gè)棉花主產(chǎn)區(qū)煙粉虱地理種群的生物型組成，并分析5個(gè)地理種群與其他省種群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。［結(jié)果］Q型煙粉虱為湖北省棉花主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群，而武漢溫室種群則均為B型煙粉虱，土著生物型ZHJ1型在大田中略有分布；系統(tǒng)發(fā)育分析表明，湖北省棉花主產(chǎn)區(qū)B型和Q型煙粉虱種群均與中國(guó)其他多個(gè)省的煙粉虱種群親緣關(guān)系較近。［結(jié)論］本文研究結(jié)果可以為湖北省5個(gè)棉花主產(chǎn)區(qū)煙粉虱的有效防治提供參考。

煙粉虱； 生物型； PCR-RFLP； 系統(tǒng)發(fā)育分析

＊ 通信作者 E-mail：weihuama＠m(xù)ail.hzau.edu.cn 2006年在武漢地區(qū)大發(fā)生，煙粉虱由原來(lái)的次要害蟲(chóng)迅速上升為主要害蟲(chóng)［3］。目前，雖然已有報(bào)道稱Q型煙粉虱在我國(guó)長(zhǎng)江流域已成為優(yōu)勢(shì)種群［1］，但湖北省主要棉區(qū)煙粉虱生物型組成仍不明了。此外，外來(lái)入侵生物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究對(duì)于闡明生物入侵途徑、尋找有效天敵、了解生物入侵后生物學(xué)特性變化以及提出有效控制策略均有重要意義［4］。本文通過(guò)VspI-mtCOIPCR-RFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)湖北省主要5個(gè)棉花產(chǎn)區(qū)的煙粉虱地理種群生物型進(jìn)行鑒定，以明確武漢、荊州、孝感、隨州、武穴5個(gè)棉花主產(chǎn)區(qū)煙粉虱生物型組成，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析湖北棉花主產(chǎn)區(qū)煙粉虱種群與其他省種群的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

供試種群分別采自湖北五大棉花主產(chǎn)區(qū)，其寄主均為棉花‘鄂棉23’，地理種群、采集地、生物型、采集時(shí)間、樣本量及GenBank查詢碼見(jiàn)表1。

表1 湖北省棉花上煙粉虱種群及生物型鑒定

1.2 單頭煙粉虱DNA提取

參照 Kirk等［5］和 Frohich等［6］方法，略有改動(dòng)。取單頭煙粉虱在ddH2O中清洗，置于含有60μL堿裂解液（50mmol／L，Tris-HCl（pH8.0），20mmol／L NaCl，1.0mmol／L EDTA，1%SDS）的1.5mL離心管中，用勻漿器充分勻漿后，在55℃水浴鍋中溫育1h。取出后，加入2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，冰浴2h。12 000r／min離心10min，去除上清液，70%乙醇清洗沉淀，再次12 000r／min離心10min，棄上清液后室溫風(fēng)干，ddH2O溶解后即可用于PCR反應(yīng)。

1.3 PCR擴(kuò)增及電泳

所用引物 C1-J-2195（5′-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3′），tRNA-1576 （5′-TATAAATCTTAAAACTGCA-3′）［7］。擴(kuò)增出大小約為800 bp的PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，含2.5UTaq酶，引物C1-J-2195和tRNA-1576（10μmol／L）各2μL，模板DNA 2μL。反應(yīng)體系于94℃預(yù)變性5min后，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：94℃ 變性1min；50℃退火1min；72℃延伸1min。循環(huán)結(jié)束后72℃ 延伸5min。PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后于凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.4 VspI-mtCOI PCR-RFLP鑒定生物型

PCR產(chǎn)物直接用于限制性內(nèi)切酶VspI（特異性識(shí)別位點(diǎn)：ATTAAT）酶切反應(yīng)，酶切的方法和步驟完全參照酶產(chǎn)品說(shuō)明書（Ferment Inc.，Glen Burnie，MD）。酶切后于1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后于凝膠成像系統(tǒng)下觀察。B型煙粉虱個(gè)體的mtCOI基因片段酶切后為大小約700bp的單一條帶，而Q型煙粉虱個(gè)體的mtCOI基因片段酶切后為大小約500bp和300bp的2條譜帶［8－10］。

1.5 序列測(cè)定與數(shù)據(jù)分析

PCR產(chǎn)物純化后送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至 GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）。得到的測(cè)序結(jié)果用Clustal W進(jìn)行排序分析，比較所得序列之間的差異，并與GenBank中煙粉虱mtCOI部分序列進(jìn)行比較。以溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）相應(yīng)的mtCOI基因片段序列為外群，通過(guò)p-distance模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育聚類樹(shù)（MEGA 3.0），系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各分支的置信度（boostrap）均進(jìn)行2 000次重復(fù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-RFLP鑒別湖北五大棉花主產(chǎn)區(qū)煙粉虱地理種群生物型

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，每個(gè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物約850bp（圖1）。由圖1可見(jiàn)，武漢、孝感、荊州、武穴和隨州大田的煙粉虱種群的VspI酶切產(chǎn)物都會(huì)在電泳后顯示兩條可見(jiàn)譜帶，一條大小約為500bp，另一條大小約300bp，而武漢溫室的兩個(gè)煙粉虱種群VspI酶切產(chǎn)物都會(huì)在電泳后顯示1條大小約700bp的可見(jiàn)譜帶。根據(jù)VspI-mtCOI PCR-RFLP鑒定生物型結(jié)果，采自武漢、孝感、武穴、隨州和荊州大田的煙粉虱種群都為Q型，而采自武漢溫室的煙粉虱種群均為B型（圖1）?？傮w來(lái)看，湖北棉花主產(chǎn)區(qū)大田煙粉虱種群以Q型為主，而溫室種群則均為B型煙粉虱。

圖1 煙粉虱mtCOI DNA PCR產(chǎn)物及VspI酶切產(chǎn)物膠片圖

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖2可見(jiàn)，采自溫室的煙粉虱種群與福建、云南、廣東、廣州、海南、山西、北京、內(nèi)蒙古、河南、浙江以及山東的B型煙粉虱聚為同一進(jìn)化支，而ZHJ型和外族溫室白粉虱各聚為一進(jìn)化支，說(shuō)明湖北武漢溫室B型煙粉虱與多個(gè)省份的B型種群親緣關(guān)系較近。

圖2 中國(guó)B型、ZHJ型煙粉虱系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

與B型煙粉虱相似，采自湖北武漢、隨州、荊州、孝感的煙粉虱種群以及武穴種群的大部分個(gè)體與多個(gè)省份的Q型種群親緣關(guān)系較近，且所有Q型個(gè)體都處于同一分支（圖3）。但是武穴種群的一部分煙粉虱個(gè)體（WuXue09-2，HM597858；WuXue09-4，HM597860；WuXue09-5，HM597861；2009年10月鑒定，表1，圖3）與中國(guó)浙江的ZHJ1型種群聚為同一進(jìn)化支，這不僅說(shuō)明武穴的煙粉虱種群由Q型和ZHJ1型兩個(gè)生物型組成（圖3），而且也說(shuō)明VspI-mtCOIPCR-RFLP技術(shù)在區(qū)分Q型和ZHJ1型煙粉虱時(shí)存在缺陷。2個(gè)月后，再次檢測(cè)武穴品系生物型組成，則發(fā)現(xiàn)所有被測(cè)個(gè)體都為Q型煙粉虱（WuX-ue09-6，HM626150；WuXue09-7，HM626151；WuX-ue09-8，HM626152；WuXue09-7，HM626151；2009年12月鑒定，表1，圖3），說(shuō)明在室內(nèi)飼養(yǎng)條件下，Q型煙粉虱的種群競(jìng)爭(zhēng)能力優(yōu)于土著ZHJ1型煙粉虱。

圖3 中國(guó)Q型、ZHJ型煙粉虱系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

煙粉虱生物型種類眾多，除B型和Q型煙粉虱外，大部分生物型都分布在特定的區(qū)域。B型和Q型煙粉虱均是近20年來(lái)世界上分布范圍最廣的外來(lái)入侵物種之一，并分別在20世紀(jì)末和21世紀(jì)初侵入我國(guó)，使我國(guó)棉花、蔬菜及觀賞植物等種植業(yè)蒙受巨大經(jīng)濟(jì)損失［11－12］。目前，煙粉虱的防治措施主要還是依靠化學(xué)防治，據(jù)報(bào)道，B型和Q型煙粉虱對(duì)藥劑的敏感性往往不同，且不同生物型煙粉虱對(duì)寄主植物的適應(yīng)性不同［13］，因此，明確煙粉虱地理種群的生物型組成，對(duì)制定合理有效的防治措施意義重大。本文通過(guò)VspI-mtCOIPCR-RFLP和mtCOI序列分析的方法，在湖北省五大棉花主產(chǎn)區(qū)共鑒定出3種煙粉虱生物型，它們分別是B型（武漢溫室）、Q型（武漢、隨州、武穴、荊州及孝感大田）和ZHJ1型（武穴大田）（表1）。其中，Q型煙粉虱分布最廣，在所有采集地均有分布，為大田優(yōu)勢(shì)種群；B型煙粉虱僅在溫室中有分布，且在溫室中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Q型個(gè)體；ZHJ1型僅在武穴棉區(qū)有少量分布，是唯一一個(gè)土著煙粉虱種群。萬(wàn)方浩等曾報(bào)道，Q型煙粉虱為長(zhǎng)江流域的優(yōu)勢(shì)種群［1］，與本文結(jié)果一致。此外，分別于2008、2009年2次自溫室采集到的煙粉虱種群不僅均為B型煙粉虱，且同源性極高（圖2），說(shuō)明B型煙粉虱種群在溫室中能穩(wěn)定存在，并可能常年發(fā)生，而不受Q型煙粉虱影響，與大田情況相反?？傊?，湖北省Q型煙粉虱在棉花大田條件下占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而B(niǎo)型煙粉虱則在溫室條件下優(yōu)勢(shì)較明顯，土著生物型ZHJ1型在大田中也有零星分布。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，湖北省武漢溫室B型和棉花主產(chǎn)區(qū)Q型煙粉虱均與多個(gè)周邊省份煙粉虱種群親緣關(guān)系較近（圖2，3），說(shuō)明入侵湖北的煙粉虱種群主要來(lái)源于國(guó)內(nèi)種群遷入，而并非國(guó)外入侵種群直接侵入。此外，無(wú)論B型和Q型煙粉虱，所有被檢測(cè)個(gè)體在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上都處于同一進(jìn)化支，由此可以推測(cè)，中國(guó)多省B型或Q型煙粉虱不同地理種群間的遺傳差異較小，這說(shuō)明中國(guó)多省煙粉虱地理種群間基因交流較頻繁，無(wú)明顯地域阻隔。

武穴煙粉虱種群一部分與浙江的ZHJ1型聚為同一進(jìn)化支，這不僅說(shuō)明武穴的煙粉虱種群由Q型和ZHJ1型2個(gè)生物型組成（表1，圖3），而且也說(shuō)明VspI-mtCOIPCR-RFLP技術(shù)在區(qū)分 Q 型 和ZHJ1型煙粉虱時(shí)存在缺陷。據(jù)報(bào)道，PCR-RFLP技術(shù)是當(dāng)前眾多煙粉虱生物型分子鑒定技術(shù)中操作最簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)代價(jià)最低、應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，且已有報(bào)道證明VspI-mtCOIPCR-RFLP技術(shù)可適用于鑒別世界各地的B型和Q型煙粉虱種群，而本文的發(fā)現(xiàn)卻說(shuō)明，該技術(shù)在用于鑒別Q型和土著生物型ZHJ1型煙粉虱時(shí)存在缺陷，需要后續(xù)研究尋找出更精確的煙粉虱生物型鑒定技術(shù)。

武穴煙粉虱種群在室內(nèi)飼養(yǎng)2個(gè)月后的生物型組成為40%Q型和60%ZHJ1型（表1，圖3），說(shuō)明武穴種群在田間為Q型和ZHJ1型2個(gè)生物型組成的混合種群，且兩生物型間的比例接近1∶1。但在室內(nèi)飼養(yǎng)4個(gè)月后，該種群則變?yōu)镼型煙粉虱種群（表1，圖3），說(shuō)明ZHJ1型和Q型煙粉虱存在種群競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象，且在室內(nèi)飼養(yǎng)條件下，Q型煙粉虱的種群競(jìng)爭(zhēng)能力明顯優(yōu)于ZHJ1型煙粉虱，而與大田條件下的情況不同。但兩生物型間的種群競(jìng)爭(zhēng)機(jī)理尚不清楚，需要開(kāi)展進(jìn)一步的研究。

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Biotype distribution and phylogenetic analysis ofBemisia tabacipopulations in main cotton planting areas in Hubei Province

Zhou Xingai1， Ma Weihua1， Liu Meigang2， Yang Xiaohong3， Wang Mo1
（1.Hubei Key Laboratory of Insect Resources Utilization and Sustainable Pest Management，Huazhong Agricultural University，Wuhan430070，China； 2.Xiantao Station of Plant Protection，Hubei433000，China；3.Qianjiang Station of Plant Protection，Hubei433104，China）

［Objective］To understand the biotypes ofBemisia tabaciof cotton in main planting areas of Wuhan，Jingzhou，Xiaogan，Suizhou and Wuxue in Hubei Province.［Method］In this study，PCR-RFLP of mtCOI and gene sequencing method were used to identify the biotypes of whitefly field populations from main cotton planting areas in Hubei Province，and phylogenetic analysis of them was also conducted.［Result］The Q biotype was dominant in the field populations，while the B biotype was dominant in greenhouse populations.In addition，ZHJ1 biotype was also identified in Wuxue population.Phylogenetic analysis showed that populations from main cotton planting areas in Hubei Province were always homologous with populations from most other provinces in China.［Conclusion］The results may provide a reference for the control ofB.tabaciin Hubei Province.

Bemisia tabaci； biotype； PCR-RFLP； phylogenetic analysis

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（200803005）；植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（SKL2010OP03）；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)新教師經(jīng)費(fèi)（5220408080，5220409004）

S 435.622.9

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.012

煙粉虱［Bemisia tabaci（Gennadius）］又名棉粉虱、甘薯粉虱、銀葉粉虱，在世界各地均有分布。其危害包括直接吸取植物汁液，分泌蜜露影響植物的光合作用，以及傳播植物病毒，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。煙粉虱是一個(gè)正處于快速進(jìn)化過(guò)程的復(fù)合種（species complex），截至2005年，煙粉虱已有26個(gè)種群被賦予特定生物型，包括A、AN、B、B2、C、Cassava（木薯）、D、E、F、G、G／H、H、I、J、K、L、M、N、NA、Okra （秋葵）、P、Q、R、S、ZHJ、FJ型［1］，不同的煙粉虱生物型在寄主范圍、傳毒能力、地理分布及抗藥性等方面存在顯著差異［2］。

在湖北省，煙粉虱一直作為次要害蟲(chóng)存在，但于

2010-11-03

2010-11-25