馬曉建，楊君芳，常 春

(鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南鄭州450001)

0 引言

木聚糖酶能將自然界中含量豐富的木聚糖降解為低聚木糖、木糖及少量其他單糖，在農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、造紙工業(yè)、飼料工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用［1］.木聚糖酶可由自然界中廣泛存在的真菌、放線菌、細(xì)菌、酵母菌等微生物發(fā)酵產(chǎn)生.而黑曲霉生長(zhǎng)迅速、發(fā)酵周期短，且發(fā)酵過程不產(chǎn)生毒素、安全、可靠，是公認(rèn)安全的微生物，具有明顯的優(yōu)越性［2-3］.因此，選育高產(chǎn)木聚糖酶的黑曲霉菌株并對(duì)其發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，有助于開發(fā)、研制木聚糖酶制劑，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一.

目前，用于優(yōu)化發(fā)酵條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法有很多，比如正交實(shí)驗(yàn)法和響應(yīng)面分析(Response Surface Methodology，RSM)［4］.響應(yīng)面分析比正交實(shí)驗(yàn)法更為有效，因?yàn)樗捎昧烁鼮榻?jīng)濟(jì)的方式和更為合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，考慮實(shí)驗(yàn)的隨機(jī)誤差，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更為全面的分析，在化學(xué)工業(yè)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)以及食品學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用［5-6］.為此，筆者通過液態(tài)發(fā)酵篩選得到一株產(chǎn)木聚糖酶的黑曲霉菌株，并運(yùn)用響應(yīng)面分析方法對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，為進(jìn)一步的放大研究提供參考.

1 材料和方法

1.1 出發(fā)菌種

黑曲霉(Aspergillus niger)：鄭州大學(xué)生化中心實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 培養(yǎng)基

斜面及平板培養(yǎng)基 PDA：去皮馬鈴薯200 g切成小塊加入1 000 mL水煮沸30 min，然后用紗布過濾，加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，溶化后補(bǔ)足水至1 000 mL，pH自然，121℃滅菌30 min.

液體篩選培養(yǎng)基(g/L)：麩皮15 g，蛋白胨10 g，KH2PO430 g，NaNO330 g，CaCl25 g，MgSO4·7 H2O 5 g，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.007 5 g，MnSO4· H2O 0.002 5 g，ZnSO40.02 g，CoCl20.03 g［7］.

發(fā)酵條件優(yōu)化培養(yǎng)基(g/L)：玉米芯20 g，麩皮 10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，(NH4)2SO41.4 g，KH2PO42 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，MgSO4·7 H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.005 g，MnSO4·H2O 0.001 6 g，ZnSO4·7 H2O 0.001 4 g，CoCl2·6 H2O 0.003 7 g［8］.

1.3 主要儀器

電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);LDZX-40AI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);標(biāo)準(zhǔn)型潔凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司);隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);PHS-3C型精密酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司);722N可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司).

1.4 菌種的分離和篩選

(1)菌種活化.采用PDA斜面活化出發(fā)菌株，接種后于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d.

(2)菌種篩選.用接種環(huán)從活化后菌種斜面上取2環(huán)孢子接入液體培養(yǎng)基中，于30℃，150 r/min的條件下培養(yǎng)4 d，然后測(cè)定菌種的酶活.

1.5 酶活測(cè)定方法

木聚糖酶活的測(cè)定

取1 mL1.0%的木聚糖溶液(溶于pH=4.8乙酸緩沖液中)于10 mL的刻度具塞試管中，再準(zhǔn)確加入0.5 mL一定稀釋度的待測(cè)酶液(空白管不加)，50℃水浴30 min后，立即加入2 mL DNS試劑，再于空白管中準(zhǔn)確加入0.5 mL一定稀釋度的待測(cè)酶液.充分混勻后，置于沸水浴中5 min，然后迅速取出冷卻至室溫，加蒸餾水定容至10 mL，搖勻.樣品在波長(zhǎng)540 nm下測(cè)定吸光度，將吸光度平均值代入線性回歸方程求出木糖的含量.

木聚糖酶活力定義單位：在上述條件下，每小時(shí)分解底物釋放出1 μmol木糖所需要的酶量為一個(gè)單位(U/mL).

1.6 發(fā)酵條件優(yōu)化設(shè)計(jì)方法

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析的方法對(duì)黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化.

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選

將編號(hào) F-1、F-2、F-3、F-4、F-5、G-1、G-2、G-3、G-4、G-5，共 10 株黑曲霉菌株接入液體篩選培養(yǎng)基中，通過測(cè)定木聚糖酶活來篩選高產(chǎn)木聚糖酶的菌株.篩選結(jié)果見圖1.從圖1中可以看出：F-3的酶活最高，為162.20 U/mL，因此最終選定F-3為實(shí)驗(yàn)菌株，進(jìn)行下面的優(yōu)化實(shí)驗(yàn).

圖1 黑曲霉篩選結(jié)果Fig.1 Screening results from Aspergillus niger

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

根據(jù)RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案［9］并參考預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和起始pH為考察因素，分別設(shè)為X1、X2、X3，每個(gè)因素取3個(gè)水平，共設(shè)計(jì)了15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，3個(gè)為零點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3次，以估計(jì)誤差.以每毫升酶液的木聚糖酶活力作為響應(yīng)值Y.實(shí)驗(yàn)因素水平見表1，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2.

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1 Experimental factors and levels

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Experimental design and results of RSM

利用SAS軟件運(yùn)行表2中的數(shù)據(jù)，得到的回歸方程為

上述方程的決定系數(shù)R2=0.900 4，表明回歸方程的擬合程度良好.回歸方程的方差分析表見表3.

表3中P值為顯著性概率，當(dāng)小于0.05時(shí)說明影響顯著，小于0.01時(shí)影響高度顯著.因此，X1的一次項(xiàng)、X1的平方項(xiàng)顯著;X2的一次項(xiàng)不顯著、X2的平方項(xiàng)顯著;X3的一次項(xiàng)不顯著、X3的平方項(xiàng)高度顯著，這說明3個(gè)考察因素對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量都有一定的影響，但方差分析中交互項(xiàng)不顯著，這說明可以不考慮3個(gè)考察因素的交互作用［10］.

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 The results of analysis of variance

發(fā)酵時(shí)間、溫度和起始pH值3個(gè)因素的響應(yīng)面分析圖分別見圖2、圖3、圖4.

圖2 X1，X2對(duì)Y值響應(yīng)面分析圖(X3=0)Fig.2 Analysis of the RSM of Y=f(X1，X2)

從圖2可以看出發(fā)酵溫度X1、發(fā)酵時(shí)間X2對(duì)黑曲霉F-3液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶酶活的影響，在最優(yōu)點(diǎn)處X1、X2無論是增加或減少都對(duì)黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶的酶活有消極影響［11］.

由圖3可見黑曲霉F-3液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的酶活隨發(fā)酵溫度X1、起始pH值X3的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在發(fā)酵溫度為30℃、起始pH為4.85左右時(shí)，木聚糖酶酶活最高.

圖4為Y1=f(X2，X3)的響應(yīng)面分析圖(X1=0)，反映出類似上述的變化規(guī)律，在發(fā)酵時(shí)間為98 h左右、pH為4.85時(shí)，木聚糖酶酶活最高.

對(duì)利用SAS軟件得到的回歸方程求一階偏導(dǎo)并使其等于零，可得到響應(yīng)面的最大值.即3個(gè)因素的最佳值：溫度為30.8℃、發(fā)酵時(shí)間為98.7 h、起始pH為4.85，此時(shí)木聚糖酶酶活最優(yōu)值為265.08 U/mL.按上述的最佳條件做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終測(cè)得的酶活結(jié)果見表4.

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 The results of validation experiment U/mL

3 結(jié)論

通過液態(tài)發(fā)酵篩選得到一株高產(chǎn)木聚糖酶的黑曲霉菌株F-3，其最高酶活為162.20 U/mL.利用響應(yīng)面分析的方法對(duì)黑曲霉菌株F-3的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和起始pH進(jìn)行了初步優(yōu)化，確定了其最優(yōu)發(fā)酵條件為溫度30.8℃、發(fā)酵時(shí)間98.7 h、起始pH值為4.85，使其產(chǎn)木聚糖酶的最高酶活可達(dá)266.41 U/mL，比之前提高了64.25%.

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