南文金 ，王清華 ，趙永剛 ，吳曉東 ，包靜月 ，王志亮

（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國家外來動(dòng)物疫病診斷中心，山東青島 266032；2.韶關(guān)學(xué)院英東動(dòng)物疫病研究所，廣東韶關(guān) 512005）

小反芻獸疫（Peste des Petits Ruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒（Peste des Petits Ruminants virus，PPRV）引起的小反芻動(dòng)物（特別是山羊和綿羊）的烈性，接觸性傳染病。具有極高的發(fā)病率和死亡率，主要侵害淋巴組織及消化道上皮組織，病癥包括高熱、大量的眼鼻分泌物、流涎、壞死性口炎、胃腸炎及支氣管肺炎，解剖時(shí)在大腸可見特異性斑馬條痕[1-2]。

PPRV是副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbitlivirus）成員[2]。該病最早流行于非洲赤道到撒哈拉地區(qū)[3]，近年來在南亞地區(qū)廣泛流行并不斷蔓延。雖然我國把它作為重要的外來動(dòng)物疫病進(jìn)行了預(yù)防，但2007年P(guān)PR還是在我國與印度接壤的西藏阿里地區(qū)暴發(fā)，造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

早期該病主要用同屬的牛瘟病毒疫苗預(yù)防[5-6]。1989年開始使用同種的弱毒疫苗株預(yù)防該病并且取得了很好的效果。弱毒疫苗在預(yù)防PPR中發(fā)揮了重要作用，但弱毒疫苗存在著散毒和毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，而且疫苗株和野毒株在血清學(xué)上無法區(qū)分，這就影響到小反芻獸疫流行病學(xué)調(diào)查。因此，研究一種安全、有效的新型疫苗勢在必行。

本研究克隆了小反芻獸疫病毒H基因，構(gòu)建了PPRV-H基因重組山羊痘病毒，為研究小反芻獸疫基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

質(zhì)粒：PtkPgpt-egfpP（本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的山羊痘病毒通用載體）；病毒：山羊痘病毒（GPV）疫苗毒株購自吉林正亞公司；菌株：DH5α（本實(shí)驗(yàn)室保存）；PPRV的cDNA產(chǎn)物（本實(shí)驗(yàn)室保存）；原代山羊睪丸細(xì)胞（LT，常規(guī)方法制作）；培養(yǎng)基為10%血清（北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所）DMEM（Invitrogen公司）；轉(zhuǎn)染試劑為Promega公司的的Mammalian TransFection System-Calcium Phosphate；膠回收純化試劑盒購自TANGEN公司；各種內(nèi)切酶為大連寶生物產(chǎn)品。

1.2 小反芻獸疫病毒H基因擴(kuò)增

以PPRV的cDNA產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增PPRV的H基因。根據(jù)GenBank中登錄的小反芻獸疫病毒H基因序列。利用DANStar和Primer Premier 5.0軟件分析設(shè)計(jì)了一對引物：

PPRV-P15'-TCA GTCGAC ATG TCC GCA CAA AGG GAA-3'

PPRV-P25'-GCAG ACTAGT TCA GAC TGG ATT ACA TGT T-3'

上游和下游引物分別引入SalⅠ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）中各成分 模板：PPRV的cDNA 產(chǎn)物 2 μL；10×PCR buffer（Mg2+Plus）：2.5 μL；dNTPs：2 μL；引物：P1、P2 各 1 μL （25 pmol/μL），r-Taq 酶：0.5 μL，去離子滅菌水：16 μL。

PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃5 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。

1.3 重組質(zhì)粒PtkPgpt-egfpPpprv-H構(gòu)建和鑒定

1.3.1 重組質(zhì)粒PtkPgpt-egfpPpprv-H構(gòu)建模式

PCR擴(kuò)增得到的PPRV-H基因用SalⅠ和SpeⅠ酶切，膠回收后，和經(jīng)過相同酶切處理的質(zhì)粒PtkPgptegfpP連接，重組質(zhì)粒命名為PtkPgpt-egfpPpprv-H，EGFP基因在啟動(dòng)子P11的下游，gpt基因位于EGFP基因的下游，PPRV-H基因位于啟動(dòng)子P7.5的下游（圖1）。大量制備重組質(zhì)粒PtkPgpt-egfpPpprv-H，測質(zhì)粒濃度。

1.3.2 重組質(zhì)類PtkPgpt-egfpPpprv-H酶切鑒定

分別用三種酶切方法鑒定重組質(zhì)粒PtkPgpt-egfpPpprv-H

酶切體系 A ddH2O：11 μL，質(zhì)粒：5 μL，10×H Buffer：2 μL，EcoRⅠ：2 μL；

酶切體系 B ddH2O：11 μL，質(zhì)粒：5 μL，10×H Buffer：2 μL，SalⅠ：0.8 μL，SpeⅠ：1.2 μL；

酶切體系 C ddH2O：11 μL，質(zhì)粒：5 μL，10×M Buffer：2 μL，HindⅢ：1 μL，SpeⅠ：1 μL?；靹蚝?37 ℃水浴2 h，瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 重組山羊痘病毒的制備，純化及鑒定

六孔板上鋪LT細(xì)胞，待細(xì)胞長成單層后，GPV疫苗株感染六孔板上長成單層的LT細(xì)胞，37℃吸附2 h，鈣轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PtkPegfp-gptPpprv-H，轉(zhuǎn)染方法按轉(zhuǎn)染試劑盒的說明（Promega公司）進(jìn)行。轉(zhuǎn)染12 h后用10%DMSO休克，休克24 h后在熒光顯微鏡下觀察六孔板拿到是否有熒光。待90%細(xì)胞病變后收毒。獲得的重組病毒在六孔板上進(jìn)行第一代盲篩。

第一代盲篩后，在含5%血清的DMEM培養(yǎng)基中加入霉酚酸（Mycophenolic acid，MPA，50 μ g/mL），次黃嘌呤（Hypoxanthine，30μ g/mL）和黃嘌呤（Xanthine，500 μ g/mL）進(jìn)行壓力篩選和蝕斑純化[7-8]。純化3代后，每代選擇有綠色熒光蛋白表達(dá)的病毒，提取病毒核酸DNA，用羊痘病毒TK基因的引物作PCR鑒定，若擴(kuò)增產(chǎn)物為650 bp左右的條帶，則說明PPRV-H沒有重組進(jìn)入山羊痘病毒，若擴(kuò)增產(chǎn)物為3570 bp左右的條帶，則說明PPRV-H基因成功插入山羊痘病毒基因組。

2 結(jié)果

2.1 PPRV-H基因的PCR擴(kuò)增

引物PPRV-P1和PPRV-P2擴(kuò)增產(chǎn)物大小1830bp，與理論值相符（圖2）。

2.2 重組質(zhì)粒PtkPgpt-egfpPpprv-H的鑒定

把重組質(zhì)類PtkPgpt-egfpPpprv-H用EcoRⅠ單酶切，線性化的重組質(zhì)粒大小為6500 bp左右，和理論值相符；用SalⅠ和SpeⅠ雙酶切后得到的片段大小為1800 bp和4750 bp左右，和理論值相符；用HindⅢ和SpeⅠ雙酶切后，得到大小為2435 bp和4750 bp左右的目的片段，和理論值相符（圖3）。

2.3 重組病毒rGPV-PtkPgpt-egfpPpprv-H的純化

10%DMSO休克24 h后，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞孔在熒光顯微鏡下可以看到大量綠色熒光表達(dá)（圖4A），陰性對照孔沒有綠色熒光表達(dá)（圖4B）。待90%細(xì)胞病變后，收獲細(xì)胞毒反復(fù)凍融3次在六孔板上盲篩一代。從第二代開始，重組病毒反復(fù)凍融3次后在96 孔板上做 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五個(gè)梯度感染 LT細(xì)胞。在不完全DMEM培養(yǎng)液中加入霉芬酸，黃嘌呤和次黃嘌呤進(jìn)行壓力篩選。進(jìn)行3代壓力篩選后，即能看見典型的表達(dá)綠色熒光的痘斑（圖4C）。挑取典型的痘斑繼續(xù)作梯度稀釋在96孔板上傳代，直到?jīng)]有野毒痘斑出現(xiàn)。

2.4 重組病毒的PCR鑒定

提取純化小反芻獸疫病毒H基因重組山羊痘病毒核酸，用羊痘病毒TK基因引物擴(kuò)增得到3570bp左右的目的條帶。分別用重組質(zhì)粒rGPV-PtkPgptegfpPpprv-H和GPV病毒核酸做陰性對照和陽性對照（圖 5）。

3 討論

本研究中利用的山羊痘病毒通用轉(zhuǎn)移載體PtkPgpt-egfpP是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的，該通用轉(zhuǎn)移載體為背靠背啟動(dòng)子，啟動(dòng)子P11下游克隆了報(bào)告基因EGFP和壓力篩選基因gpt用于重組病毒的篩選。在啟動(dòng)子P7.5的下游克隆了PPRV-H基因，這樣報(bào)告基因和外源病毒保護(hù)性抗原基因在背靠背啟動(dòng)子作用下，向相反的方向轉(zhuǎn)錄，使得重組病毒的克隆純化和傳代方便快捷，又避免了外源蛋白之間的相互干擾，影響外源病毒保護(hù)性抗原的免疫原性。

在重組病毒的篩選中，理論上只要出現(xiàn)CPE的細(xì)胞都應(yīng)該是重組病毒，并且有EGFP的表達(dá)，但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，有的細(xì)胞有CPE卻沒有EGFP的表達(dá)，這可能是與MPA的純度和反復(fù)凍融有關(guān)，是否因?yàn)镋GFP和gpt基因融合表達(dá)后gpt失去了應(yīng)用的功效有待進(jìn)一步研究。所以在該重組病毒篩選中，為了加快篩選進(jìn)程，在壓力篩選的同時(shí)做了蝕斑試驗(yàn)，只挑選有綠色熒光蛋白表達(dá)的典型痘斑進(jìn)行傳代。

山羊痘病毒的培養(yǎng)只能選用綿羊原代睪丸細(xì)胞或腎細(xì)胞，本研究中選用的是綿羊睪丸細(xì)胞。山羊痘病毒疫苗株在細(xì)胞上的生長周期長，病變緩慢，一般都要7～10 d，在TK基因中插入外源基因后產(chǎn)生細(xì)胞病變更為緩慢，但原代細(xì)胞培養(yǎng)條件要求高，而且傳代次數(shù)不能太高，超過5代細(xì)胞狀態(tài)明顯下降，往往是EGFP剛少量表達(dá)，還尚未形成典型的痘斑病變時(shí)細(xì)胞就從培養(yǎng)板上脫落，延緩了研究進(jìn)程。因此，為了促進(jìn)重組山羊痘病毒相關(guān)研究的開展，需要建立適合羊痘病毒繁殖的傳代細(xì)胞系。

在重組病毒的鑒定上，本研究在篩選中進(jìn)行了3代純化后，每一代都選擇細(xì)胞培養(yǎng)孔中有EGFP表達(dá)的病毒提取核酸進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)選擇沒有EGFP表達(dá)的孔進(jìn)行對照，直到只能在有EGFP表達(dá)的重組病毒核酸中擴(kuò)增到目的條帶，而沒有EGFP表達(dá)的GPV核酸中PCR擴(kuò)增到的只有野毒的條帶，這樣可以確保擴(kuò)增到的目的條帶不是由于細(xì)胞轉(zhuǎn)染中質(zhì)粒的污染造成的假陽性。

最后，用山羊痘病毒TK基因的引物PCR擴(kuò)增得到大小為3570 bp左右的目的片段，而提取到的同代次山羊痘病毒疫苗株核酸用TK基因的引物擴(kuò)增，得到的大小為650 bp左右的目的片段，證明PPRV-H成功插入到山羊痘病毒基因組中，為進(jìn)一步研究PPRV H基因重組山羊痘病毒免疫原性奠定了基礎(chǔ)。

[1]Amjad H，Qamar.Peste des Petits Ruminants in goats in Pakistan[J].Vet Rec，1996，139（5）：118-119.

[2]殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1997.

[3]南文金，王清華，吳曉東，等.小反芻獸疫病毒分子生物學(xué)與疫苗研究進(jìn)展[J].中國動(dòng)物檢疫，2009，26（1）：62-65.

[4]王志亮，包靜月，吳曉東，等.我國首例小反芻獸疫診斷報(bào)告[J].中國動(dòng)物檢疫，2007，24（8）：24-26.

[5]Taylor WP.Protection of goats against peste des petits ruminants with attenuated rinderpest virus[J].Res Vet Sci，1979，27（3）：321-324.

[6]Taylor WP，al Busaidy S，Barrett T.The epidemiology of peste des petits ruminants in the Sultanate of Oman [J].Vet Microbiol，1990，22（4）：341-352.

[7]Falkner FG，Moss B.Escherichia coli gpt gene provides dominant selection for vacciniavirus open reading frame expression vectors[J].J Virol，1988，62（6）：1849-1854.

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