李增魁，馬 蘭，種偉雄

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

食源性病源微生物品安全的重要因素，其中大腸桿菌O157:H7是腸出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagic escherichia coli，EHEC） 的一個主要菌型，是近年來新發(fā)現(xiàn)的嚴(yán)重危害人類生命健康的一種腸道病原性微生物，也是近年來在食品衛(wèi)生及腸道感染領(lǐng)域中最重要的研究進(jìn)展之一。腸出血性大腸桿菌O157:H7主要通過食物傳播，牛、羊、豬和雞等家畜家禽是其主要貯存宿主。感染此菌可使人患腹瀉、出血性結(jié)腸炎（HC），也可引發(fā)溶血性尿毒綜合癥（HUS）及血檢形成性血小板減少性紫癜（TTP）等嚴(yán)重并發(fā)癥等，甚至死亡。

E.coli O157:H7于1983年被首次分離[1]，屬于腸桿菌科埃希氏菌屬。革蘭氏染色陰性，無芽孢，有鞭毛，動力試驗呈陽性。1996年在日本發(fā)生的EHEC O157:H7的暴發(fā)流行，引起出血性腹瀉，先后波及30多個都、府、縣，感染近萬人，并造成12人死亡，引起了全世界的關(guān)注[2]。以前O157:H7大腸桿菌僅為世界發(fā)達(dá)國家引起食物中毒的暴發(fā)流行，與畜食類制品有關(guān)[3]。近來國內(nèi)本菌流行尚有抬頭之勢[4-6]。據(jù)報道市場零售肉類污染率，牛肉為3.7%，豬肉1.5%，羊肉2.0%，禽肉1.5%，認(rèn)為這都與屠宰過程中污染有關(guān)[7]。2010年，我們按傳統(tǒng)方法對西寧部分市場的動物性食品進(jìn)行了大腸桿菌O157:H7選擇培養(yǎng)，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試樣來源

羊肉及牛肉各20份均采自西寧市樂家灣屠宰場，豬肉、雞腸、雞蛋各20份、鹵肉10份采自莫家街、小橋、商業(yè)巷等市場。

1.1.2 菌株

大腸桿菌Escherichia coli O157:H7菌株86-24購于廣東省微生物菌種保藏中心；試驗菌株均從試樣中分離。

1.1.3 實驗試劑

頭孢克肟（上海海虹實業(yè)）、亞碲酸鉀（華北化學(xué)試劑開發(fā)中心）、山梨醇（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、新生霉素（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）、月桂基硫酸鈉（華北地區(qū)特種化學(xué)試劑開發(fā)中心）、三號膽鹽（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.1.4 實驗儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱（蘇州宏拓電子有限公司）、移液槍（上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司）、暗箱式紫外線透射分析儀 MODEL Fs-312（上海復(fù)生生物工程研究所）、回旋式氣浴恒溫振蕩器SHZ-82（金壇市科技儀器有限公司）。

1.1.5 培養(yǎng)基

1.1.5.1 蛋白胨水配方 蛋白胨1 g，氯化鈉0.5 g，水加至100mL pH調(diào)至7.8；胰蛋白胨20g，3號膽鹽1.5 g，乳糖 5 g，磷酸二氫鉀 1.5 g，磷酸氫二鉀 4 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1000mL。

以上成分混合、加熱、融化，調(diào)節(jié)pH6.9±0.2，高壓滅菌，冷至50℃左右，加新生霉素，新生霉素終濃度為 20 μ g/mL，傾倒平板即可。

1.1.5.2 改良山梨醇麥康凱瓊脂（TC-SMAC）培養(yǎng)基配方 蛋白胨7 g；眎蛋白胨3 g；豬膽鹽5 g；山梨醇10g；氯化鈉5 g；瓊脂18 g；0.5%中性紅水溶液5mL；0.01%結(jié)晶紫水溶液10mL；亞碲酸鉀2.5 mg；頭孢克肟0.05 g；蒸餾水1000mL，pH7.2。

除山梨醇、指示劑、抑菌劑外，115℃滅菌20min至50℃，加入山梨醇，滅菌的0.01%結(jié)晶紫水溶液、0.5%中性紅水溶液，過濾除菌的1%亞碲酸鉀250μL和50g/L頭孢克肟1mL。

1.1.5.3 MUG-LST肉湯培養(yǎng)基配方 胰蛋白胨20g，氯化鈉5 g，乳糖5 g，磷酸二氫鉀2.75 g，磷酸氫二鉀2.75 g，月桂基硫酸鈉0.1 g，蒸餾水1000mL。

分裝到有倒立發(fā)酵管的試管中，每管10mL，pH6.8±0.2，121℃滅菌15min。加MUG終濃度0.1g/L。

1.1.5.4 NFA培養(yǎng)基配方 酪蛋白胨20g，肉浸膏2 g，酵母浸膏1 g，山梨醇10g，枸櫞酸鐵銨0.5 g，硫代硫酸鈉2 g，去氧膽酸鈉1.12 g，溴酚藍(lán)0.025 g，瓊脂 13 g，蒸餾水 1000mL。pH7.4，121 ℃滅菌 15min。

1.1.5.5 營養(yǎng)平板和肉湯 按常規(guī)配方配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 E.coli O157:H7的顯微形態(tài)

通過革蘭氏染色和鞭毛染色來觀察其顯微形態(tài)，確定其為革蘭氏陰性菌并有鞭毛存在。

1.2.2 E.coli O157∶H7的增菌培養(yǎng)

1.2.2.1 無菌稱取25 g試樣于225mL mEC增菌液，（41±1）℃培養(yǎng) 18～24 h。

1.2.2.2 接種于TC-SMAC上，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)，若菌落扁平、透明或半透明，邊緣光滑、呈淡褐色中心直徑越2mm，視為可疑菌落。

1.2.2.3 挑取5～10個可疑菌落接種于MUG-LST，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h。觀察MUG-LST培養(yǎng)結(jié)果，若出現(xiàn)產(chǎn)氣且無熒光者判為MUG陰性培養(yǎng)物。

1.2.2.4 可疑菌接至NFA培養(yǎng)基（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)。

1.2.2.5 同時轉(zhuǎn)接普通營養(yǎng)瓊脂（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3 E.coli O157:H7的生理生化特性 根據(jù)E.coli O157:H7具有大腸桿菌的通性，如發(fā)酵葡萄糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣等，同時還具有自身的特性，如不發(fā)酵山梨醇或遲緩發(fā)酵山梨醇設(shè)計了E.coli O157:H7的生理生化實驗，其中檢測項目包括葡萄糖、乳糖、木糖、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、甘露醇的發(fā)酵實驗、檸檬酸鹽利用實驗、過氧化氫酶實驗、苯丙氨酸脫氨實驗、賴氨酸與精氨酸脫羧酶實驗、硝酸鹽還原實驗以及精氨酸雙水解酶實驗。

2 結(jié)果

2.1 檢出率 對西寧市售的動物性食品羊肉20份、牛肉20份、豬肉20份、雞肉20份、牛奶20份、鹵肉10份共110份進(jìn)行了檢驗，從羊肉中檢出大腸桿菌O157:H71株，占0.9%。

表1 6類食品中EHEC O157:H7的檢出情況

2.2 分離菌株生物學(xué)性狀

2.2.1 形態(tài) 分離菌株均為革蘭陰性無芽胞桿菌，在營養(yǎng)肉湯和EC肉湯中生長良好，在TC-SMAC平板上37℃培養(yǎng)24 h后的菌落形態(tài)呈菌落扁平、透明或半透明，邊緣光滑，呈淡褐色中心；普通大腸桿菌呈粉紅色菌落。純培養(yǎng)物接種NFA培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24 h觀察，20min在暗室中長波紫外燈下，為綠色菌落。普通大腸桿菌呈黃色菌落，且產(chǎn)生有很強(qiáng)的電藍(lán)色熒光。在MUG-LST肉湯培養(yǎng)基中，產(chǎn)氣，無熒光。

2.2.2 生化反應(yīng)特性 均符合大腸桿菌特征，能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，系統(tǒng)生化見表2。

由表2可見:分離到的菌株發(fā)酵葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，木糖、棉子糖、甘露醇呈陽性；遲緩發(fā)酵山梨醇；賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶實驗、過氧化氫酶實驗呈陽性，硝酸鹽還原實驗、側(cè)金盞花醇、苯丙氨酸脫氨實驗、硫化氫均為陰性，這些結(jié)果都符合典型的E.coli O157:H7的生理生化特性[8]，并可與腸桿菌科絕大部分菌區(qū)分[9]；致賀氏菌屬、耶爾森氏菌屬和愛德華氏菌屬不發(fā)酵葡萄糖；檸檬酸細(xì)菌屬不與賴氨酸反應(yīng)；沙雷鐵氏菌屬、克雷伯氏菌屬和變形菌屬不與精氨酸反應(yīng)。以上這些菌屬都可通過上述生理生化反應(yīng)來加以區(qū)分（不包括變異株）。

表2 試驗菌株與參考菌株的生化特性比較

3 分析與討論

3.1 新病原性微生物和重新抬頭的病原微生物是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界面臨的一個新的課題，對人類健康構(gòu)成重大威脅。腸出血性大腸桿菌O157:H7就是其中之一[10]。以前E.coli O157:H7僅為世界發(fā)達(dá)國家引起食物中毒的暴發(fā)流行[3]，近年來國內(nèi)對本菌多有檢測[4-6]。目前有人從蔬菜及熟肉制品中分離出O157:H7腸出血性大腸桿菌，從而證實了EHEC在我國食品中存在感染[11]。本次調(diào)查從市售羊肉中分離到了疑似E.coli O157:H7，檢出率為0.9%，豬肉、牛肉、雞蛋和鹵肉中未檢出。這提示我市動物性食品中存在食源性致病菌污染，應(yīng)予以重視。也證明了綿羊確是O157:H7貯存宿主。豬肉、牛肉、雞蛋、熟肉雖未檢出致病菌，可能與季節(jié)氣溫較低或取樣品數(shù)量等有關(guān)，加強(qiáng)食品衛(wèi)生管理，控制可能出現(xiàn)的傳染源，切斷傳播途徑，提高群眾防范意識，是杜絕O157:H7食物中毒暴發(fā)流行的關(guān)鍵所在。

3.2 本次分離的菌株經(jīng)鑒定，菌體形態(tài)典型，培養(yǎng)及生化特性均符合于大腸桿菌的定義，并具有不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇的特性，同時在O157:H7的選擇性培養(yǎng)基TC-SMAC平皿上生長出典型的扁平、透明或半透明，邊緣光滑，呈淡褐色中心的菌落。NFA培養(yǎng)基平板上在暗室中長波紫外燈下，為綠色菌落。March等[12]用TC-SMAC平皿對O157:H7進(jìn)行檢測，其檢測的靈敏度為100%，但是特異性只有85%，準(zhǔn)確率只有86%。為了提高檢測效率，在SMAC培養(yǎng)基中加入鼠李糖（rharose）和頭孢克肟（cefixime）改進(jìn)，成為CT-SMAC培養(yǎng)基[13]，提高了分離的準(zhǔn)確性；FARMER等[14]利用O157:H7有H7抗原，而其他大腸桿菌只有10%的具有H7抗原的特性，設(shè)計了H7抗血清—山梨醇發(fā)酵培養(yǎng)基，其假陽性率小于1%。但是由于O157:H7與其他一些病原菌有共同的特性，用單一的方法檢測，無論如何都達(dá)不到滿意的效果，對此我國[15]以及FDA[16]在制定檢測標(biāo)準(zhǔn)時加了生理生化特性驗證和血清（免疫）學(xué)驗證，以保證檢測的準(zhǔn)確性。

3.3 本次分離的菌株在MUG-LST肉湯培養(yǎng)基中，產(chǎn)氣，無熒光。李景學(xué)等[17]認(rèn)為96%的大腸桿菌具有葡萄糖醛酸酶，故水解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），產(chǎn)生熒光，而O157:H7則為陰性反應(yīng)。

3.4 Krishman等[18]分別報道的24株和37株O157:H7的生化結(jié)果，其山梨醇均為陰性，而賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、棉子糖和衛(wèi)矛醇均為陽性，故以這5種生化特性作為O157:H7與普通大腸桿菌的鑒別要點。但葉青[19]分離的O157:H7中2株為山梨醇陽性、棉子糖陽性，1株衛(wèi)矛醇陽性。故說明有的菌株發(fā)生變異，其部分生化反應(yīng)也不完全一樣。Krishman證實，山梨醇、MUG陰性、棉子糖陽性僅發(fā)生于大腸桿菌O157:H7血清型，對檢測該菌非常有效。本次分離到的菌株發(fā)酵葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，木糖、棉子糖呈陽性；遲緩發(fā)酵山梨醇；賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶實驗、過氧化氫酶實驗呈陽性，硝酸鹽還原實驗、側(cè)金盞花醇、苯丙氨酸脫氨實驗、硫化氫均為陰性。此結(jié)果與國內(nèi)學(xué)者的結(jié)果一致。

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