趙華棟 范學(xué)軍 伍 明 樊建華 周 平 (中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長沙 4003)

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組能降解細(xì)胞外基質(zhì)的鋅依賴性蛋白酶，在動脈粥樣硬化形成及斑塊的不穩(wěn)定性改變中，能起著主要的作用。目前基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)與頸動脈粥樣硬化斑塊特別是早期斑塊內(nèi)新生血管的關(guān)系尚不肯定。本研究旨在通過檢測早期斑塊形成過程中MMP-9、TIMP-1及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)水平，結(jié)合超聲造影檢查，以探討其在早期斑塊內(nèi)新生血管形成中的作用及對斑塊穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康雄性新西蘭大白兔40只，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為4組，每組10只，空白對照組(A組)、高脂飲食組(B組)、硅橡膠圈干預(yù)聯(lián)合高脂飲食14及28 d組(C組、D組)，所有動物經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 硅橡膠圈制作 參考劉恒方等〔1〕的方法，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)?zāi)康模柘鹉z圈采用液體醫(yī)用硅膠在模具(由中國機(jī)械工業(yè)第六研究設(shè)計(jì)院提供)中塑型為標(biāo)準(zhǔn)制作。

1.3 制作動脈粥樣硬化模型及取材 經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射3%的戊巴比妥鈉液 (30 mg/kg)，麻醉成功后，頸部正中切口，密閉型硅橡膠圈，置入右側(cè)頸動脈外膜。左側(cè)為偽手術(shù)組，接受相同操作，在縫合皮下前將硅橡膠圈取出。術(shù)后將牽拉的血管和神經(jīng)放回原位置，硅橡膠圈開口處用硅膠封閉，避免硅膠和頸動脈的外膜接觸，術(shù)后75%酒精消毒切口處，肌注青霉素4萬U/次，2次/d，共計(jì)3 d。術(shù)后次日給予高脂飼料 (1%膽固醇+6%花生油+99%普通飼料)喂養(yǎng)，共喂養(yǎng)28 d。經(jīng)超聲造影證實(shí)頸動脈斑塊模型制作成功后 (C組14 d超聲造影后，其余三組飼養(yǎng)28 d后)隨即過量麻醉處死動物，快速切除放置硅膠管處及對側(cè)相應(yīng)的頸動脈組織，置入甲醛中固定，標(biāo)本石蠟包埋，常規(guī)HE染色和Masson染色。

1.4 超聲造影 造模第14天、第28天行超聲以及超聲造影檢查。超聲下觀察兔左、右頸動脈斑塊形成情況。并以超聲下定位清楚的硅橡膠圈段頸動脈斑塊為超聲造影檢查對象，經(jīng)耳緣靜脈快速團(tuán)注SonoVue造影劑 (上海博萊科信宜藥業(yè)有限責(zé)任公司)，實(shí)時觀察并儲存造影全過程。對比觀察并收集各組有頸動脈斑塊的白兔的兩次數(shù)據(jù)。造影后通過彩色超聲診斷儀自帶的聲學(xué)定量分析軟件繪制頸動脈斑塊內(nèi)和頸動脈管腔內(nèi)的時間-強(qiáng)度曲線 (TIC)，測定其峰值強(qiáng)度 (PI)。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測及結(jié)果判定 鼠抗兔MMP-9多克隆抗體、鼠抗兔TIMP-1多克隆抗體及兔抗人VEGF單克隆抗體均購自美國Thermo公司，CD31鼠單克隆抗體購自Abcam公司。石蠟包埋后標(biāo)本行5 μm厚連續(xù)切片，一張行HE染色，一張行Masson染色，余者采用ABC法行免疫組化染色，染色步驟按說明進(jìn)行。所有切片在尼康80i熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并采集放大100倍及400倍時圖像，頸動脈斑塊內(nèi)MMP-9、TIMP-1、CD31、VEGF陽性表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)棕褐色或棕黃色、淡黃色顆粒。圖像采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量斑塊內(nèi)陽性細(xì)胞積分光密度 (IOD)值及面積并計(jì)算MOD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，對資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，兩變量間相關(guān)性分析采用線性相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)觀察 頸動脈超聲A組、B組未見斑塊形成，第14天C組7只、D組10只兔硅橡膠圈段頸動脈管腔有不同程度狹窄，粥樣斑塊形成，超聲造影顯示斑塊內(nèi)有新生血管形成，D組28 d超聲造影PI值明顯高于14 d(43.09±3.28，P＜0.05)，C、D組14 d的 PI值差異無顯著性 (24.37±1.58，23.72±2.09，P＞0.05)。

2.2 組織學(xué)觀察 C組、D組HE染色示兔右側(cè)硅橡膠圈段頸動脈管壁不光滑，管腔內(nèi)有斑塊形成，內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜下脂質(zhì)浸潤，平滑肌細(xì)胞增生排列紊亂，斑塊內(nèi)有CD31陽性表達(dá)標(biāo)記的新生血管形成。A組和B組未見明顯斑塊形成。見圖1。

2.3 免疫組化分析

2.3.1 MMP-9、TIMP-1的表達(dá) MMP-9、TIMP-1亦是胞質(zhì)陽性表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒視為陽性著色，在斑塊的肩部及巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞聚集區(qū)高表達(dá)，MMP-9、TIMP-1在A組、B組內(nèi)膜無明顯陽性表達(dá);在C組、D組斑塊有陽性表達(dá)，且隨斑塊的進(jìn)展，MMP表達(dá)有所增高，TIMP-1表達(dá)減少，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)。見表1，圖2。

2.3.2 VEGF的表達(dá) VEGF蛋白是胞漿陽性表達(dá)，呈棕黃色，在斑塊內(nèi)部及血管內(nèi)膜均有著色，A組和B組家兔頸動脈動脈內(nèi)膜基本上無血管內(nèi)皮生長因子表達(dá);C組與D組家兔頸動脈斑塊及血管內(nèi)膜層染色血管內(nèi)皮生長因子均有陽性表達(dá)，D組表達(dá)明顯多于C組 (t=8.546，P＜0.01)。見表1，圖 3。

2.3.3 CD31的表達(dá) CD31標(biāo)記的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性染色呈棕黃色或棕褐色。A組、B組頸動脈內(nèi)膜無CD31表達(dá);C組、D組CAS斑塊內(nèi)有CD31陽性表達(dá)標(biāo)記的新生血管形成，且D組較C組新生血管明顯增多 (t=2.647，P＜0.05)。見表1，圖4。

2.3.4 相關(guān)性分析 在頸動脈早期斑塊組織中CD31的表達(dá)與MMP-9/TIMP、VEGF呈明顯正相關(guān) (P＜0.01);CD31與MMP-9和TIMP-1表達(dá)均無明顯相關(guān)性 (P＞0.05)。

表1 C、D組MMP-9、MMP-9/TIMP-1、VEGF、TIMP-1及CD31蛋白表達(dá)水平比較(±s)

表1 C、D組MMP-9、MMP-9/TIMP-1、VEGF、TIMP-1及CD31蛋白表達(dá)水平比較(±s)

與C組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

組別MMP-9 MMP-9/TIMP-1 VEGF TIMP-1 CD31 C組(n=10) 0.391 5±0.127 1 0.598 6±0.110 2 0.224 4±0.031 40.633 7±0.076 1 0.275 5±0.035 8 D組(n=10) 0.420 6±0.236 2 0.894 3±0.291 3 0.316 4±0.046 51) 0.571 2±0.127 9 0.389 1±0.032 32)

圖1 各組動脈HE染色結(jié)果(×200)

圖2 頸動脈斑塊MMP-9、TIMP-1免疫組化結(jié)果(×200)

圖3 C、D兩組頸動脈斑塊VEGF免疫組化結(jié)果(×200)

圖4 C、D兩組頸動脈斑塊CD31免疫組化結(jié)果(×400)

3 討論

臨床研究表明，頸動脈粥樣硬化易損斑塊的形成和發(fā)展與斑塊內(nèi)新生血管形成密切相關(guān)〔2〕。新生血管可以促進(jìn)頸動脈粥樣硬化病變的發(fā)展，甚至誘發(fā)斑塊內(nèi)出血和斑塊破裂，從而導(dǎo)致急性心腦血管疾病的發(fā)生。Moreno等〔3〕研究人類破裂的動脈粥樣硬化性斑塊中的新生血管數(shù)量，發(fā)現(xiàn)破裂斑塊內(nèi)的微血管密度明顯高于未破裂斑塊，得出粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管密度和斑塊不穩(wěn)定性呈正相關(guān)的結(jié)論。

超聲造影是常規(guī)超聲檢查的有效補(bǔ)充，除具有可以清晰地顯示頸動脈血管壁內(nèi)中膜(尤其是前壁)厚度，發(fā)現(xiàn)常規(guī)超聲易漏診的斑塊，較清晰顯示頸動脈遠(yuǎn)端及深部病變，精確判斷頸動脈狹窄程度或閉塞等優(yōu)勢外〔4～6〕，還可以實(shí)時追蹤并顯示斑塊內(nèi)新生微小血管，根據(jù)增強(qiáng)情況對斑塊的易損性進(jìn)行可視化定量評估。近年來國內(nèi)外研究表明，超聲造影對頸動脈斑塊內(nèi)新生血管的監(jiān)測具有較高的敏感性，根據(jù)其增強(qiáng)情況對斑塊內(nèi)新生血管的密度進(jìn)行定量研究，從而評估斑塊的易損性。Shah等〔7〕對頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)的患者分別行斑塊超聲造影及病理組織學(xué)CD31、CD34免疫組化分析，證實(shí)了頸動脈斑塊內(nèi)新生血管形成的造影增強(qiáng)超聲成像與手術(shù)標(biāo)本的半定量組織學(xué)評分之間具有很好的相關(guān)性。

在斑塊新生血管形成過程中，MMPs起著重要作用，MMPs通過降解基底膜和重塑細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)使內(nèi)皮細(xì)胞從原有血管遷移到外周形成新生血管〔8〕。MMP-9是MMP家族中重要的一員，可以降解Ⅳ型膠原和明膠，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附，客觀上有利于新生血管形成，TIMP-1是MMP-9的天然抑制劑，可與其1∶1結(jié)合而抑制其活性。研究表明，在腫瘤新生血管中，單純的MMPs升高并不一定導(dǎo)致新生血管形成，只有在MMPs與其抑制劑不平衡時才導(dǎo)致基質(zhì)降解的不適當(dāng)增加從而導(dǎo)致腫瘤組織新生血管形成增多〔9〕。本研究證實(shí)在頸動脈早期斑塊中新生血管形成與MMP-9/TIMP-1呈正相關(guān)，說明MMP/TIMP比例失調(diào)是導(dǎo)致頸動脈斑塊內(nèi)新生血管形成的主要原因之一。

VEGF是促血管新生的重要因子，通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異受體結(jié)合，發(fā)揮強(qiáng)大的促內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促血管生成作用〔10〕。研究表明，VEGF與MMPs具有相互促進(jìn)作用。MMPs可以降解血管基膜及細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附，在新生血管形成中發(fā)揮重要作用;而VEGF則能特異性地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，提高血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解;同時，TIMPs通過抑制MMPs的活性，抑制血管生成素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽生長等，防止ECM降解，維持血管的穩(wěn)定性，它們相互影響，共同參與斑塊內(nèi)新生血管的發(fā)生、發(fā)展〔11〕。在本研究中，D組斑塊內(nèi)VEGF表達(dá)較C組明顯增多，即隨著時間的延長斑塊內(nèi)新生血管增多且與斑塊中MMP-9/TIMP-1呈正相關(guān)。

1 劉恒方，李新華，楊期東，等.改良硅橡膠圈加高膽固醇喂養(yǎng)誘導(dǎo)頸動脈狹窄兔模型的建立〔J〕.中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2007;10(1):17-9.

2 Juan-Babot JO，Martinez-Gonzalez J，Berrozpe M，et al.Neovascularization in human coronary arteries with lesions of different severity〔J〕.Rev Esp Cardiol，2003;56:978-86.

3 Moreno PR，Purushothaman KR，Sirol M，et al.Neovascularization in human atherosclerosis〔J〕.Circulation，2006;113(12):2245-52.

4 魏立亞，何 文，項(xiàng)東英，等.超聲造影在血管疾病中的應(yīng)用〔J〕.中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2008;24(10):7-10.

5 鄔東方，何 文，張紅霞，等.頸動脈硬化閉塞癥的超聲造影研究〔J〕.中華超聲影像學(xué)雜志，2007;16(8):393-6.

6 項(xiàng)東英，何 文，寧 彬，等.門靜脈栓子的超聲造影表現(xiàn)〔J〕.中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志，2008;16(1):15-7.

7 Shah F，Balan P，Weinber M，et al.Contrast enhanced ultrasound imaging of atherosclerotic plaque neovascularization:a new surrogate marker of atherosclerosis〔J〕?Vasc Med，2007;12(2):291-7.

8 Joseph DR，Raouf AK.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease〔J〕.Biochem Pharmacol，2008;75(6):346-59.

9 Vempati P，Karagiannis ED，Popel AS.A biochemical model of matrix metalloproteinase 9 activation and inhibition〔J〕.J Biol Chem，2007;282(52):37585-96.

10 Hyder SM，Stancel GM.Regulation of angiogenic growth factors in the female reproductive tract by estrogens and progestins〔J〕.Mol Endol，1999;13(6):806-11.

11 夏玉芳，婁艷輝，于云鵬，等.MMP-2、TIMP-2及VEGF蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型組織中的表達(dá)及意義〔J〕.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007;4(13):313-5.