劉長山 王秀軍 孫麗萍 柳 林 明 義 劉海霞 (濰坊市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 濰坊 261041)

糖尿病腎病(DN)的發(fā)生、發(fā)展和嚴(yán)重程度與高血糖升高程度及持續(xù)時間密切相關(guān)〔1〕，高血糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是DN的重要發(fā)病機制。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡參與了DN發(fā)生的整個過程，但氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究資料不多。本研究對糖尿病大鼠模型測定組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，觀察腎臟細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變及凋亡相關(guān)蛋白的表達，并予以抗氧化劑α-硫辛酸和具有抗氧化作用的中藥甘草酸進行干預(yù)治療，以研究氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，探討抗氧化劑防止細(xì)胞凋亡進而防治DN可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康雄性6周齡Wistar大鼠，體重180～200 g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國 Alexi公司。α-硫辛酸購自德國史達德藥廠(批號:81526)。甘草酸購自南京正大天晴制藥有限公司(批號:國藥準(zhǔn)字H20051942)。DL-甘油醛購自美國Sigma公司。NADPH購自美國Roche公司。bcl-2、bax免疫組化測定藥盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。H-7500透射電鏡，日本HITACHI公司。UV-260型分光光度計，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1 w后，隨機取10只作為正常對照組喂養(yǎng)常規(guī)飼料，其余30只擬作為糖尿病觀察組。于左下腹腔按60 mg/kg體重注射STZ溶液，注射后72 h斷尾用羅氏血糖儀測血糖，血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型建立。將30只模型大鼠隨機分為糖尿病模型組、α-硫辛酸治療組和甘草酸治療組，每組10只，各組間血糖值無差異。每日灌胃給藥，α-硫辛酸組 10 mg·kg－1·d－1，甘草酸組 30 mg·kg－1·d－1，糖尿病模型組和正常對照組則用等容量生理鹽水1 ml/100 g/d。于實驗的第 4，8，12，16 周測定血糖，16 w 時處死大鼠。期間大鼠死亡1只，共有39只大鼠完成全部實驗研究。用10%水合氯醛按400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。取右腎組織放于4%中性甲醛中固定，進行HE染色及免疫組化染色。取左腎少量皮質(zhì)，切成約1 cm3左右小塊，放入3%戊二醛固定，進行電鏡觀察。取左腎剩余皮質(zhì)稱重，置于-70℃冰箱保存，進行丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定。腎臟病理觀察采用常規(guī)HE染色。

1.2.2 bcl-2、bax蛋白免疫組織化學(xué)染色 常規(guī)石蠟切片，透明、復(fù)水，按1∶100比例稀釋的小鼠抗大鼠bax和bcl-2抗體，滴加生物素化羊抗小鼠IgG二抗工作液，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的卵白素工作液，DAB顯色。

1.2.3 腎組織透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察 將組織切成1 mm3左右的小塊，用3%戊二醛固定。1%鋨酸后固定，Epon812包埋。在透射電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 實驗前后大鼠體重與血糖變化 藥物干預(yù)試驗前各糖尿病大鼠體重與正常對照組均無明顯差異(P＞0.05)，血糖均顯著高于正常對照組(P＜0.01)，治療16 w結(jié)束時，糖尿病各組大鼠體重明顯低于正常對照組(P＜0.01)，兩治療組血糖與治療前比較無顯著差異(P＞0.05)，糖尿病各組間體重?zé)o明顯差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體重和血糖比較(±s)

表1 各組大鼠體重和血糖比較(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01

組別 n 體重(g)實驗前 實驗16 w后血糖(mmol/L)實驗前 實驗16 w后正常對照組 10 272.2±12.3 505.4±55.6 7.13±1.02 7.52±0.90糖尿病模型組 9 272.8±14.5 315.5±24.31)21.39±8.281)22.66±7.43 α-硫辛酸組 10 274.7±11.1 297.1±24.21)21.68±7.591)23.37±8.38甘草酸組 10 274.6±10.9 298.0±25.41)21.12±7.461)23.12±8.01

2.2 α-硫辛酸、甘草酸對糖尿病大鼠腎臟MDA、SOD的影響

與正常對照組比較，糖尿病各組大鼠腎組織勻漿MDA水平顯著升高(P＜0.01)，SOD降低(P＜0.01);α-硫辛酸治療組、甘草酸治療組與糖尿病模型組比較，MDA水平降低(P＜0.05)，SOD升高(P＜0.01)，兩治療組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表2 大鼠腎臟丙二醛、超氧化物歧化酶水平比較(±s)

表2 大鼠腎臟丙二醛、超氧化物歧化酶水平比較(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與糖尿病模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 n SOD(nU/mg) MDA(nmol/mg prot)正常對照組10 5.66±44.94 2.66±0.61糖尿病模型組 9 4.69±26.231) 4.30±0.391)α-硫辛酸治療組 10 5.38±21.741)3) 3.08±0.281)2)甘草酸治療組 10 5.25±18.731)3) 2.99±0.201)2)

2.3 腎臟病理學(xué)觀察 光鏡下見正常對照組大鼠腎小球毛細(xì)血管形態(tài)及分布無異常，糖尿病模型組見腎小球毛細(xì)血管充血、擴張，腎小球明顯增大，腎小球系膜區(qū)擴張和基膜不同程度增厚，腎小球細(xì)胞數(shù)目減少，腎小球細(xì)胞外基質(zhì)明顯增多，系膜區(qū)擴大。而各糖尿病治療組腎小球增大不明顯，腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)輕度增生，較糖尿病模型組病變明顯減輕。

2.4 bcl-2蛋白表達結(jié)果 bcl-2蛋白主要位于腎小管，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表達。正常對照組大鼠腎臟bcl-2蛋白明顯表達，糖尿病模型組腎小管bcl-2蛋白表達減少，而兩糖尿病治療組Bcl-2蛋白表達較糖尿病模型組組增多。

2.5 bax蛋白表達結(jié)果 bax蛋白在腎小球、腎小管均有表達，表達在胞漿內(nèi)。正常對照組表達較弱，糖尿病模型組蛋白表達明顯增多，而治療組蛋白表達較糖尿病模型組減少。

2.6 透射電子顯微鏡細(xì)胞凋亡觀察 電鏡下可見正常大鼠腎小管上皮細(xì)胞有微絨毛，細(xì)胞胞膜完整，細(xì)胞器豐富，基底膜質(zhì)膜內(nèi)褶，線粒體良好，無線粒體腫脹。糖尿病模型組大鼠腎組織系膜細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)趨邊濃縮、聚集、細(xì)胞核周間隙增寬，線粒體明顯腫脹，細(xì)胞質(zhì)吞飲泡大量增多，上皮細(xì)胞內(nèi)見凋亡小體。腎小管上皮細(xì)胞核固縮，核染色質(zhì)邊集。糖尿病治療組大鼠腎組織細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)趨邊減輕線粒體腫脹不明顯。

3 討論

細(xì)胞凋亡在DN的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用，糖尿病高血糖狀態(tài)下的代謝紊亂使細(xì)胞凋亡增加是發(fā)生DN的重要原因，多種病理類型腎病的發(fā)生發(fā)展及損傷后的修復(fù)過程均伴隨著細(xì)胞凋亡參與〔2〕。

高血糖通過何種途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機制尚不完全清楚，有研究提示，高血糖導(dǎo)致氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，當(dāng)外源性活性氧及細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加、清除ROS能力下降和抗氧化能力減弱時可致細(xì)胞凋亡，機制:活性氧誘導(dǎo)NF-κB表達;氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的與凋亡相關(guān)的基因除了與bcl-2有關(guān)外，c-Myc和Fas-FasL也參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔3，4〕。

本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，糖尿病時，高血糖通過增加腎臟氧化應(yīng)激而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax的表達，誘導(dǎo)腎小管、腎小球細(xì)胞凋亡而參與DN的發(fā)生發(fā)展?？寡趸委煂N的病理損害有明顯的保護作用。

甘草酸是甘草中的主要活性成分，為甘草甜素類化合物，具有廣泛的生理及藥理作用，如抗炎癥、免疫抑制、抗氧化、抑制血小板聚集，降血脂與抗動脈粥樣硬化等〔5〕。本研究發(fā)現(xiàn)甘草酸具有明顯抗氧化的作用，其作用效果與典型抗氧化劑α-硫辛酸相近，可改善DN動物模型腎臟病理變化及細(xì)胞凋亡，可見，中藥甘草酸在防治DN中有較好的臨床應(yīng)用前景。

1 DCCT:TheDiabetesControland ComplicationsTrialResearch Group.The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus〔J〕.N Engl J Med，1993;329(14):977-86.

2 Sano K，F(xiàn)ujigaki Y，Miyaji T，et al.Role of apoptosis in uranyl acetateinduced acute renal failure and acquired resistance to uranyl acetate〔J〕.Kidney Int.2000;57(4):1560-70.

3 Collins M，Rivas A.The control of apoptosis in mammalian cells〔J〕.Trends Biochem Sci，1993;18(8):307-9.

4 Kamimoto Y，Sugiyama T，Kihira T，et al.Transgenic mice overproducing human thioredoxin-1，an antioxidative and anti-apoptotic protein，prevents diabetic embryopathy〔J〕.Diabetologia，2010;53(9):2046-55.

5 李開龍，張建國，王慧民，等.甘草酸18α體對梗阻性腎病大鼠腎間質(zhì)中NF-κB表達的影響〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2004;20(1):31-3.