陳文雙 張新樂(lè) 徐道華 (廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 湛江 524023)

長(zhǎng)期大劑量使用糖皮質(zhì)激素對(duì)腦損害的作用十分突出。血漿中高水平的糖皮質(zhì)激素持續(xù)作用可以透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，危害中樞神經(jīng)系統(tǒng)〔1〕。為探討小檗堿在改善潑尼松性大鼠腦損害方面的作用，本研究擬采用大劑量醋酸潑尼松致大鼠腦損害模型，觀察潑尼松對(duì)大鼠腦組織單胺氧化酶(MAO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及腦組織結(jié)構(gòu)的影響，以及小檗堿對(duì)潑尼松大鼠腦損害的防治作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 SPF級(jí)3月齡SD大鼠50只，雄性，250～285 g，廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按體重隨機(jī)分成5組，每組10只，空白對(duì)照組(Con組)，予蒸餾水5 ml/kg灌胃1 h后再予蒸餾水 5 ml/kg灌胃;潑尼松組(GC組)，予潑尼松3.5 mg/kg灌胃1 h后再予蒸餾水5 ml/kg灌胃;小檗堿低劑量組〔GC+Ber(L)組〕，先予潑尼松3.5 mg/kg灌胃1 h后予小檗堿15 mg/kg灌胃;小檗堿中劑量組〔GC+Ber(M)組〕，先予潑尼松3.5 mg/kg灌胃1 h后予小檗堿30 mg/kg灌胃;小檗堿高劑量組〔GC+Be(H)組〕，先予潑尼松3.5 mg/kg灌胃1 h后予小檗堿60 mg/kg灌胃。1次/d，所有動(dòng)物給藥時(shí)間為12 w。

1.2 方法

1.2.1 試劑、藥品與儀器 小檗堿(純度95%，Sigma公司)，臨用前用蒸餾水配制;醋酸潑尼松(純度99%，浙江仙居藥業(yè)有限公司)，臨用前用少許吐溫-80溶解后用蒸餾水稀釋至所需容積;MAO測(cè)定試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒和考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。儀器:ELX800型酶標(biāo)儀(美國(guó)BD-Tek公司)，752紫外光柵分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)，LEICA QWIN圖像分析儀(德國(guó)萊卡公司)，ZS832I型內(nèi)切式組織勻漿機(jī)(浙新機(jī)械廠)，ASD23D愛(ài)華電子秤(深圳市愛(ài)華儀器有限公司)。

1.2.2 模型制備 采用醋酸潑尼松3.5 mg/kg灌胃大鼠，1次/d，連續(xù)給藥12 w，建立潑尼松致大鼠腦損害的模型。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.3.1 腦勻漿生化指標(biāo)測(cè)定 大鼠右心室取血后，迅速斷頭，立即取出完整大腦，左側(cè)大腦先于－20℃預(yù)存，48 h內(nèi)在冰浴上用4℃生理鹽水研磨制成10%腦勻漿，再經(jīng)ZS832I型內(nèi)切式組織勻漿機(jī)充分粉碎，離心取上清檢測(cè)MAO、SOD和腦勻漿蛋白含量。

1.2.3.2 腦組織切片標(biāo)本制備方法 打開(kāi)大鼠顱骨，取出完整大腦，觀察外觀有無(wú)特征性改變;然后將右側(cè)大腦用Bouin固定液固定進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片。根據(jù)包新民等〔2〕大鼠腦立體定位圖譜在距離前囟向尾側(cè)3～4 mm處修理組織塊，行冠狀切片，在距離前囟向尾側(cè)約3.5 mm處連續(xù)切片5～8張，厚4 mm，經(jīng)HE染色后，分別于高倍光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化，并用半自動(dòng)圖像分析儀測(cè)算海馬CA2區(qū)單位面積神經(jīng)元數(shù)目(大錐體細(xì)胞計(jì)數(shù))，測(cè)量大鼠大腦紋狀區(qū)皮質(zhì)分子層厚度和皮層總厚度。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對(duì)潑尼松大鼠腦勻漿生化指標(biāo)的影響 見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組比較，潑尼松組大鼠大腦勻漿中MAO含量顯著升高(P＜0.01)，而SOD的含量變化不明顯，提示長(zhǎng)期使用潑尼松可使大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能活動(dòng)受到限制，出現(xiàn)衰老的跡象。與潑尼松組比較，小檗堿高、中、低劑量組均可顯著降低MAO的含量(P＜0.01)，提示小檗堿可在一定程度上可對(duì)抗?jié)娔崴傻闹袠行圆涣挤磻?yīng)。

2.2 小檗堿對(duì)潑尼松大鼠腦組織結(jié)構(gòu)影響 打開(kāi)大鼠顱骨，取出完整大腦時(shí)，觀察各組大鼠大腦外觀無(wú)顯著差異，未見(jiàn)明顯的腫脹、萎縮或顏色變化。顯微鏡下可見(jiàn)空白對(duì)照組海馬神經(jīng)元分布規(guī)則，大小一致;而長(zhǎng)期使用潑尼松后大鼠海馬CA2區(qū)神經(jīng)元排列分散，胞體腫脹或皺縮，有較多的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生核固縮甚至溶解死亡。小檗堿預(yù)防藥物組海馬CA2區(qū)神經(jīng)元排列較規(guī)則，正常形態(tài)的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目較多(圖1)。通過(guò)圖像分析儀測(cè)量，與空白對(duì)照組比，長(zhǎng)期應(yīng)用潑尼松后大鼠海馬CA2區(qū)單位面積大錐體細(xì)胞數(shù)(HN)明顯下降(P＜0.01)，分子層厚度和皮層的總厚度比值(M/C)無(wú)顯著變化，提示長(zhǎng)期超生理劑量使用潑尼松可造成大鼠海馬神經(jīng)元的損傷。與潑尼松組比較，小檗堿高、中、低劑量組HN均顯著上升(P＜0.01)，M/C無(wú)明顯變化，提示小檗堿對(duì)潑尼松造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷有一定的預(yù)防作用。見(jiàn)表2。

表1 小檗堿對(duì)潑尼松大鼠腦勻漿SOD活性與MAO含量的影響(± s，U/mg prot，n=10)

表1 小檗堿對(duì)潑尼松大鼠腦勻漿SOD活性與MAO含量的影響(± s，U/mg prot，n=10)

與Con組比較:1)P＜0.01;與GC組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01，下表同

?

表2 小檗堿對(duì)潑尼松大鼠腦組織結(jié)構(gòu)的影響(± s，n=10)

表2 小檗堿對(duì)潑尼松大鼠腦組織結(jié)構(gòu)的影響(± s，n=10)

CW:大腦皮層厚度

?

圖1 各組大鼠海馬CA2區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞(錐體細(xì)胞)形態(tài)(HE，×400)

3 討論

目前臨床醫(yī)師對(duì)糖皮質(zhì)激素的急性期不良反應(yīng)比較重視，如高血壓、高血糖、尿糖、胃腸出血和穿孔、心肌肥厚及對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺軸一過(guò)性的抑制作用等〔3，4〕，對(duì)遠(yuǎn)期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)卻未引起足夠重視。而大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，糖皮質(zhì)激素治療對(duì)腦發(fā)育有不良影響，糖皮質(zhì)激素通過(guò)抑制腦胸腺嘧啶脫氧核苷酸激酶(可調(diào)節(jié)DNA的合成速度)的活性，影響嘧啶核苷酸的生物合成，使腦細(xì)胞數(shù)目明顯減少、腦重量減輕，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育明顯延遲〔3〕。實(shí)驗(yàn)中潑尼松組大鼠腦勻漿中MAO含量顯著上升，提示糖皮質(zhì)激素造成的腦損害與其腦中神經(jīng)遞質(zhì)含量紊亂有關(guān)。海馬是腦內(nèi)參與記憶的重要部分，其結(jié)構(gòu)的改變往往提示記憶功能下降，記憶衰退是生物體出現(xiàn)衰老的一個(gè)早期癥狀〔5〕。糖皮質(zhì)激素?fù)p傷海馬的機(jī)制可能與加速神經(jīng)元內(nèi)ATP消耗，引起細(xì)胞器退行性變和能量的大量消耗有關(guān)〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素可造成海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡或加速神經(jīng)元退化。

本實(shí)驗(yàn)顯示，小檗堿對(duì)長(zhǎng)期超生理劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的腦損害有一定預(yù)防作用。小檗堿通過(guò)減低局部缺血損傷和N-甲基天冬氨酸受體1免疫反應(yīng)性〔7〕保護(hù)神經(jīng)用。另外，小檗堿通過(guò)增加海馬和額葉皮質(zhì)中去甲腎上腺素(NA)和5-羥色胺(5-HT)的表達(dá)水平，也起到調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的作用〔8〕。

1 孫紅宇.糖皮質(zhì)激素對(duì)海馬神經(jīng)元影響的體外研究 (碩士論文)〔D〕，2002:2.

2 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:41-53.

3 Stark AR，Carlo WA，Tyson JE，et al.Adverse effects of early dexamethasone in extremely-low-birth-weight infants〔J〕.N Engl J Med，2001;344(2):95-101.

4 Anday EK，Conway D.Steroid therapy in the high-risk neonate:benefits and risks〔J〕.Clin Obstet Gynecol，2003;46(1):190-210.

5 張 兵，侯家驥.大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞神經(jīng)元在衰老過(guò)程中的超微結(jié)構(gòu)變化〔J〕.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，1995;1(3):249-52.

6 王旭明，朱吉林，黃 瀛.持續(xù)糖皮質(zhì)激素增高對(duì)海馬的毒性作用〔J〕.解剖學(xué)雜志，1996;19(1):48-5.

7 Yoo KY，Hwang IK，Lim BO，et al.Berberry extract reduces neuronal damage and N-Methyl-D-aspartate receptor 1 immunoreactivity in the gerbil hippocampus after transient forebrain ischemia〔J〕.Biol Pharm Bull，2006;29(4):623-8.

8 Peng WH，Lo KL，Lee YH，et al.Berberine produces antidepressant-like effects in the forced swim test and in the tail suspension test in mice〔J〕.Life Sci，2007;81(11):933-8.