周衛(wèi)華 米長忠 吳仕筠 鐘 飛 (吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

苦丁茶是我國南部和西南部民間一種常用植物，民間使用歷史悠，其主要分布在桂、粵、黔、瓊等地，苦丁茶作為一種植物藥茶在我國西部和南部地區(qū)廣泛的各民族中被廣泛飲用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有清熱解毒、殺菌消炎、健胃消積、止咳化痰、生津止渴、提神醒腦、明目益智和抗輻射、活血脈和調(diào)節(jié)血脂等功效〔1，2〕。本實驗以D-半乳糖致衰老小鼠為模型，觀察苦丁茶提取物對D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶力的影響，以便為苦丁茶應(yīng)用和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 昆明種2月齡清潔級小鼠40只，雌雄各半，體重(20±2)g，由吉首大學(xué)動物中心提供?？喽〔栀徸约资胁枞~店，產(chǎn)地為廣西大新縣溢江林場。樣品已經(jīng)水蒸氣“殺青”、晾干，并經(jīng)鑒定確認為冬青科苦丁茶。D-半乳糖，購自Sigma公司，用生理鹽水配成0.8%的濃度。SOD試劑盒(批號:091006)、MDA試劑盒(批號:091126)均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備 UV-3100紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)。TGL-16G低溫高速離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 苦丁茶提取物液的制備 苦丁茶提取液為我室自行制備，流程如下:苦丁茶葉粗粉200 g(粗粉)，15倍量水浸泡20 min，煎煮2 h，共提取2次，合并兩次液，濃縮至200 ml，使每毫升含原生藥1 g，臨用前按比例配制成高劑量為1 g/ml，低劑量為0.5 g/ml。

1.3.2 衰老動物模型的制備與實驗分組 實驗動物隨機分為4組(正常組、模型組、苦丁茶提取物高、低劑量組)，每組 10只。模型組、苦丁茶提取物兩個劑量組，頸背部皮下注射0.8%D-半乳糖 0.5 ml/20 g(200 mg/kg)，1 次/d，持續(xù) 6 w〔3，4〕，空白組注射同劑量的生理鹽水。從第1天開始，苦丁茶提取物兩個劑量組每日灌胃10 g/kg(以生藥記)、20 g/kg的苦丁茶提取物進行實驗干預(yù)，模型組和空白組也灌胃等量的生理鹽水。

1.3.3 Morris水迷宮實驗 采用改良的Morris水迷宮實驗，參考聶榮慶等〔5〕的方法，水迷宮為圓形水槽，直徑60 cm，高17 cm，水深11 cm，測試過程中室溫保持在18℃ ～22℃。在槽壁上等距離地標記4個點分別為NESW，這4個點作為實驗起始點。在NW象限中間固定位置處放一透明玻璃平臺，高9.5 cm，直徑6 cm，使其低于水面1.5 cm。在水面覆蓋一層大小相似，直徑約為1.5 mm的泡沫顆粒屑，使平臺不可見。水槽周圍有豐富的固定不變的參照物(包括試驗者本身)，以供小鼠定位。參考Williams等〔6〕的方法，訓(xùn)練共歷時5 d，分為每天上下午兩個時段，每個時段訓(xùn)練四次。訓(xùn)練開始將平臺放在NW象限的固定位置處，將小鼠從槽壁四個起始點分別放入水槽中，記錄從放入小鼠到小鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)，四次訓(xùn)練分別從不同的起點放入小鼠，小鼠找到平臺后，讓小鼠在平臺上休息30 s，再進行下一次訓(xùn)練。如小鼠120 s仍找不到平臺，則由實驗者將小鼠放置于平臺上，逃避潛伏期記為120 s，也讓小鼠在平臺上休息30 s。

1.3.4 小鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量測定 實驗結(jié)束后同一部位的腦組織150 mg，吸干水漬后置入液氮保存。測定前稱質(zhì)量，剪取適量腦組織塊，研磨成10%組織勻漿，3 000 r/min離心30 min，取上清液，按試劑盒說明書進行操作，測定上清液中SOD、MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 苦丁茶提取物對小鼠Morris水迷宮成績的影響 小鼠用D-gal皮下注射連續(xù)6 w后模型組逃避潛伏期延長〔(31.9±8.35)s〕，與正常組相比〔(22.4±5.73)s〕有顯著性差異(P ＜0.01)，灌胃給予20、10 g/kg苦丁茶提取物后，逃避潛伏期縮短〔(23.9±7.82)，(25.1±7.2)s〕，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)，但未能達到正常組水平。

2.2 苦丁茶提取物對小鼠腦組織SOD活性、MDA含量的影響模型組小鼠腦組織SOD活性降低，MDA含量升高，與正常組有顯著性差異(P＜0.01)，苦丁茶提取物灌胃給藥后小鼠腦組織中SOD活性升高，MDA含量降低，與模型組有顯著性差異(P＜0.05)，同樣未能達到正常組的水平。見表1。

表1 苦丁茶提取物小鼠腦組織SOD活性和MDA含量的影響(± s，n=10)

表1 苦丁茶提取物小鼠腦組織SOD活性和MDA含量的影響(± s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 劑量(g/kg)SOD活性(U/mg prot)MDA含量(nmol/mg prot)正常組 － 208.8±36.12) 16.68±1.362)模型組 － 151.1±35.3 19.68±1.76苦丁茶提取物低劑量組 10 177.3±30.71) 18.27±1.081)苦丁茶提取物高劑量組 20 190.2±33.41) 18.01±1.411)

3 討論

多種動物給予D-半乳糖導(dǎo)致衰老，許多研究證明，該模型動物多種細胞的病理變化也符合自然衰老時出現(xiàn)的癥狀，并用作抗衰老藥物的研究〔7〕。實驗結(jié)果表明，給予D-半乳糖后，小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力明顯下降，模型組與對照組相比，水迷宮實驗成績均明顯處于劣勢，這說明衰老模型復(fù)制是成功的。灌胃給予苦丁茶后，小鼠水迷宮實驗均明顯優(yōu)于模型組，苦丁茶能夠改善由D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

D-半乳糖可在體內(nèi)氧化產(chǎn)生自由基，當超過機體的清除能力時，可引起脂質(zhì)過氧化作用的鏈式反應(yīng)，導(dǎo)致細胞膜損傷〔8〕。自由基可作用于細胞膜，攻擊膜磷脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過氧化物，使膜的結(jié)構(gòu)功能遭到破壞，通透性增加，進一步增強細胞的損傷。SOD是清除自由基最有效酶之一，其活性增高間接證明組織清除自由基能力增強;MDA是自由基傷不飽和脂肪酸生成的脂類過氧化分解產(chǎn)物，降低可間接證明組織中自由基水平降低。有研究表明MDA可引起精神行為改變，并通過交聯(lián)、結(jié)合形成質(zhì)褐脂質(zhì)，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙〔9〕。陳薇研究表明，苦丁茶葉中含有多酚和黃酮在體外有較強的抗氧化功能〔10〕。楊彪研究表明，苦丁茶對大鼠離體肝組織的具有一定抗氧化作用，對脂質(zhì)過氧化有一定的抑制作用〔11〕。D-gal衰老模型小鼠灌胃給予苦丁茶提取SOD活力升高，MDA含量減少，表明苦丁茶提取物可減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、降低脂質(zhì)過氧化物的含量、提高機體抗氧化能力和清除自由基能力，這也可能是苦丁茶提取物提高D-gal衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、改善衰老的作用機制之一。

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