劉寶華 谷 玥 姜曉明 李海峰 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

近年發(fā)現(xiàn)吉西他濱(Gemcitabine)是一種高效低毒的抗代謝類(lèi)抗腫瘤新藥，目前已廣泛應(yīng)用于肺癌和胰腺癌〔1，2〕，但對(duì)肝癌細(xì)胞的作用效果尚不明確。本研究以人肝癌細(xì)胞株(SMMC7721)細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察吉西他濱在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與試劑 SMMC7721細(xì)胞(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供)，DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO公司)，小牛血清(Hyclone公司)，二甲基亞砜(DMSO)，四唑氮藍(lán)鹽(MTT)(Sigma公司)。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)和堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒(上海長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司)。甲胎蛋白(AFP)、血清清蛋白(ALB)放免測(cè)定盒(中國(guó)原子能科學(xué)研究院)。

1.1.2 儀器 Sanyo超凈工作臺(tái)，Olympus倒置顯微鏡，EM2000透射電鏡，流式細(xì)胞儀Epics XLⅡ型。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人SMMC7721細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞凋亡率測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成1×105/L的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液100 μl，培養(yǎng)過(guò)夜。不同濃度吉西他濱對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響:空白對(duì)照組、1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L 吉西他濱處理組分別作用48 h后，制備各細(xì)胞懸液，加入固定破膜劑和碘化丙啶(PI)染液，室溫避光反應(yīng)30 min后上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)104個(gè)細(xì)胞，重復(fù)計(jì)數(shù)3次，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定凋亡率。吉西他濱不同作用時(shí)間對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響:10 mg/L吉西他濱作用于肝癌細(xì)胞 24、48、72、96、120 h，進(jìn)行 PI染色，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定凋亡率。

1.2.3 γ-GT和ALP活性測(cè)定 細(xì)胞用0.25%胰酶消化，2 000 r/min離心10 min后，加入預(yù)冷的0.25%脫氧膽酸鈉溶解細(xì)胞，然后4℃ 12 000 r/min離心20 min，收集上清液，－70℃保存?zhèn)溆?。按酶促反?yīng)試劑盒說(shuō)明測(cè)定γ-GT和 ALP活性，總蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。γ-GT或ALP比活力(IU/g)計(jì)算公式γ-GT或ALP值 /總蛋白量。

1.2.4 AFP和ALB分泌量測(cè)定 收集經(jīng)10 mg/L吉西他濱作用48 h及相應(yīng)對(duì)照組的細(xì)胞培養(yǎng)液，4 000 r/min離心5 min，取上清冷凍干燥。細(xì)胞消化后染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。將干燥后的培養(yǎng)液溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，按放免試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定AFP和ALB的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 吉西他濱對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞凋亡的影響

2.1.1 不同濃度吉西他濱對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響 1.25、2.5、5、10、20、40 mg/L 吉西他濱作用肝癌細(xì)胞 48 h 后，凋亡百分率分別為 3.25% ±0.62%、4.68% ±0.73%、9.63% ±1.56%、18.84% ±4.26%、23.56% ±4.64%、25.85±4.67%，對(duì)照組為2.28% ±0.55%，提示對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡率隨著吉西他濱濃度的增大而升高，其中10 mg/L以上組與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.01)。

2.1.2 吉西他濱(10 mg/L)不同作用時(shí)間對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響 隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率逐漸升高，24、48、72、96、120 h，凋亡率分別為 4.37% ±0.76%、18.34% ±1.47%、26.49% ±2.43%、30.26% ±2.45%、33.58% ±2.65%，在72 h肝癌細(xì)胞凋亡率與24 h相比明顯增大(P＜0.01)。而120 h與72 h相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。提示吉西他濱促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的效果在72 h時(shí)最為明顯。

2.2 吉西他濱對(duì)肝癌細(xì)胞γ-GT活性、ALP活性及AFP、ALB分泌的影響 吉西他濱組培養(yǎng)48 h后γ-GT比活力及ALP比活力明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，AFP分泌量較對(duì)照組細(xì)胞顯著降低，ALB分泌顯著升高，與對(duì)照組比較均有顯著差異(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 吉西他濱對(duì)肝癌細(xì)胞γ-GT活性、ALP活性、AFP、ALP分泌的影響(±s)

表1 吉西他濱對(duì)肝癌細(xì)胞γ-GT活性、ALP活性、AFP、ALP分泌的影響(±s)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別γ-GT(IU/g)ALP(IU/g)ALB(g/L)AFP(μg/L)對(duì)照組 14.59±0.89 352.28±27.37 50.49±4.09 78.54±6.88吉西他濱組 10.52±0.6131)317.58±21.1931)85.59±7.6932)42.65±4.2732)

3 討論

吉西他濱是細(xì)胞周期特異性抗代謝類(lèi)藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細(xì)胞，即S期細(xì)胞，在一定條件下可以阻止G1期向 S 期的進(jìn)展〔3，4〕。

本研究中細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10～40 mg/L吉西他濱能顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，10 mg/L作用凋亡百分率可達(dá)18.84%±4.26%，并且吉西他濱對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡作用具有隨時(shí)間和劑量升高而增強(qiáng)的效果?？梢?jiàn)吉西他濱可以直接作用于肝癌細(xì)胞，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

為了探討肝癌細(xì)胞分化的定量指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)肝細(xì)胞的代謝特點(diǎn)，選擇了幾種反映肝細(xì)胞分化的特異性酶和蛋白為標(biāo)志。γ-GT在正常鼠肝中的活性極低，而在肝癌時(shí)，由于癌細(xì)胞逆分化，類(lèi)似胚胎期，此酶的生成增加，故血清γ-GT也呈中度或高度升高，臨床上也常把此酶作為觀察慢性肝炎伴肝硬化病人是否進(jìn)展為肝癌的參考指標(biāo)。ALP廣泛分布于人體的骨、肝、腸、胎盤(pán)等組織中，正常人血清中ALP主要來(lái)自骨和肝，約各占總活性一半。肝內(nèi)占位性病變，如原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌時(shí)，由于癌細(xì)胞可合成ALP，以致血中ALP中度甚至明顯升高。ALB是肝細(xì)胞分化成熟的指標(biāo)。AFP則是公認(rèn)的肝細(xì)胞增殖和惡變的重要標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)吉西他濱可抑制肝癌細(xì)胞合成、分泌γ-GT、ALP及AFP，并可相應(yīng)增加 ALB分泌量。提示吉西他濱具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞向良性細(xì)胞分化的作用，對(duì)其在臨床上的應(yīng)用有指導(dǎo)價(jià)值。

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2 Schiller J H，Harrington D，Belani CP，et al.Comparison of four chemotherapy regimens for advanced non-small cell lung cancer〔J〕.N Engl J Med，2002;346(2):92-8.

3 Hamada S，Satoh K.MSX2 overexpression inhibits gemcitabine-induced caspase-3 activity in pancreatic cancer cells〔J〕.World J Gastroenterol，2005;11(43):6867-70.

4 Rosell R，F(xiàn)elip E，Taron M，et al.Gene expression as a predictive marker of outcome in stage ⅡB-ⅢA-ⅢB non-small cell lung cancer after induction gemcitabine-based chemotherapy followed by resectional surgery〔J〕.Clin Cancer Res，2004;10(12):4215-9.