王多佳 黃莎莎 李鳳蘭 李金陽(yáng) 胡寶忠

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

黃瓜矮化突變體膨脹素Cs-EXPA2基因的克隆與表達(dá)分析

王多佳 黃莎莎 李鳳蘭 李金陽(yáng) 胡寶忠*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

采用RT-PCR的方法克隆了黃瓜矮化突變體中膨脹素Cs-EXPA2基因，并對(duì)其苗期88 h內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程中 mRNA水平表達(dá)量的差異進(jìn)行了研究，探討膨脹素基因?qū)Π挠绊懪c作用。結(jié)果顯示，Cs-EXPA2在黃瓜矮化突變體的下胚軸、根、子葉中均有不同程度的表達(dá)，利用Real-time PCR分析得出Cs-EXPA2的表達(dá)量隨時(shí)空變化，Cs-EXPA2在下胚軸中的表達(dá)模式為“低-高-低”，在根中的表達(dá)模式為“高-低-高”。

黃瓜矮化突變體；膨脹素；Cs-EXPA2；克??；Real-time PCR

致謝:本試驗(yàn)得到東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院秦智偉教授的支持，在此對(duì)園藝學(xué)院黃瓜課題組一并表示感謝。

黃瓜（Cucumis sativus L.）為我國(guó)和世界廣泛栽培的蔬菜品種之一，但大多數(shù)黃瓜品種都為蔓生品種，田間栽培占地面積大，土地利用效率低。本試驗(yàn)選用的黃瓜矮化突變體 D0462，其表型為植株矮?。ㄖ挥?0 cm高），節(jié)間縮短，幾乎不分枝，同時(shí)在苗期就表現(xiàn)出下胚軸極度縮短（僅2～3 cm）的明顯矮化性狀（孟婧 等，2009）。利用矮化突變體是選育黃瓜矮化品種的有效途徑，利用這一資源，可以選育適宜機(jī)械化操作的品種，增加種植面積，提高生產(chǎn)效率。

自 McQueen-Mason等（1992）從黃瓜下胚軸發(fā)現(xiàn)膨脹素蛋白（Expansin）以來(lái)，人們對(duì)膨脹素在植物生長(zhǎng)中的作用進(jìn)行了大量研究。研究結(jié)果表明，Expansin參與多個(gè)器官組織如葉（Fleming et al.，1997）、花（Cosgrove，2000；Pezzotti et al.，2002）、果實(shí)（Rose et al.，1997）、根（Wu & Cosgrove，2000）的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，并對(duì)細(xì)胞壁降解、種子的生長(zhǎng)和萌發(fā)、干旱脅迫處理等產(chǎn)生反應(yīng)（Cho & Cosgrove，2002）。但膨脹素對(duì)植物矮化發(fā)育的直接影響報(bào)道甚少。本試驗(yàn)克隆了黃瓜矮化突變體與正常株高品種苗期的下胚軸、根、子葉中的膨脹素基因Cs-EXPA2，并且通過(guò)Real-time PCR的方法分析了Cs-EXPA2基因的組織表達(dá)差異和時(shí)空表達(dá)量差異，探討膨脹素基因在矮化黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

黃瓜矮化突變體 D0462，對(duì)照為正常株高品種129，均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。2009年9月15日于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，28 ℃光照16 h，20 ℃黑暗8 h，分別在破土后16、24、40、48、64、72、88 h剪取D0462和129的下胚軸、根和子葉作為試驗(yàn)材料，剪取的組織迅速置于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA的提取、cDNA的合成及黃瓜Cs-EXPA2基因的克隆

用Trizol法（Invitrigen公司）提取各取樣時(shí)間點(diǎn)各器官的總RNA，cDNA第1鏈合成按照Takara公司的PrimeScriptTMRT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)Genebank中Cs-EXPA2（登錄號(hào)為U30460.1），使用Primer Premier5.0軟件在CDS兩側(cè)設(shè)計(jì)特異引物，得到1對(duì)能有效擴(kuò)增 Cs-EXPA2編碼區(qū)的引物（FP:5′-TCTGCTCCATCCTTACTTCTTCATCATC-3′；RP:5′-CACCCCTAAACCCACGATCCTAGAC-3′）。以第1鏈cDNA為模板進(jìn)行中間片段擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃5 min，94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠檢測(cè)后回收，克隆入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒鑒定后由華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件分析，并利用NCBI（http://ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST在線分析工具對(duì)Genbank的核算數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3 Real-time PCR分析

TaqMan探針?lè)y(cè)定Cs-EXPA2基因的不同時(shí)空表達(dá)量，利用Primer Express2.0設(shè)計(jì)熒光定量探針引物，在檢測(cè)探針?biāo)诎行蛄械膬啥嗽O(shè)計(jì)普通引物（FP:5′-GGTGGTGTAACCCTCCGCTT-3′；RP:5′-CCCTGTAAATGCCGATCTTCTG-3′；探針:FAM-AGCATTTCGACATGGCTCAGCCTGCBHQ），擴(kuò)增200～500 bp片段作為陽(yáng)性克隆基因。以黃瓜β-actin基因（登錄號(hào)為AB010922）為內(nèi)參，設(shè)計(jì)探針內(nèi)參（FP:5′-GTGTGAGTCACACTGTTCCCATC-3′；RP:5′-AGCAAGGTCCAAACGGAGAA-3′；內(nèi)參探針:FAM-AGGGTTACGCCCTCCCTCATGCC-BHQ1）。引物與探針均由南京博仕公司合成。應(yīng)用ABI PRISM7500實(shí)時(shí)定量PCR儀，以各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的cDNA為模板，按照試驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95 ℃30 s，PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，95 ℃5 s，60 ℃34 s。反應(yīng)結(jié)束后分析擴(kuò)增曲線。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)，Ct值取平均值。根據(jù)2-△△ct法（Kenneth et al.，2001）測(cè)定基因的相對(duì)表達(dá)量，每樣品3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cs-EXPA2基因的克隆與分析

將黃瓜下胚軸RNA反轉(zhuǎn)錄后經(jīng)PCR擴(kuò)增得到一條大約950 bp的條帶（圖1），將PCR產(chǎn)物與 T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α后，經(jīng)藍(lán)白斑篩選得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng) DNAMAN軟件分析表明于該基因有完整的ORF區(qū)，利用NCBI的BLAST在線分析工具與Genbank的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)分析，二者同源性達(dá)到99 %以上，表明Cs-EXPA2克隆成功。

2.2 Cs-EXPA2的時(shí)空表達(dá)分析

Cs-EXPA2基因在矮化突變體 D0462和正常株高品種129下胚軸中的表達(dá)量都呈先增加后降低的趨勢(shì)，在破土88 h內(nèi)都有峰值出現(xiàn)，但矮化突變體較正常株高品種出現(xiàn)峰值的時(shí)間晚大約24 h，同時(shí)矮化突變體的峰值（破土后48 h）較正常株高品種（破土后24 h）高，但之后迅速降低，甚至降到低于正常株高品種的水平（圖2-a）。

矮化突變體D0462與正常株高品種129根中Cs-EXPA2的表達(dá)量在破土16 h內(nèi)幾乎相等，但之后兩者的表達(dá)量都迅速下降，到破土48 h時(shí)矮化突變體Cs-EXPA2的表達(dá)量超過(guò)正常株高品種，但隨后兩者的表達(dá)量又都逐漸增加，正常株高品種中Cs-EXPA2的表達(dá)量增幅明顯大于矮化突變體，并始終高于矮化突變體（圖2-b）。

矮化突變體D0462子葉中Cs-EXPA2基因的表達(dá)量呈增加—降低—增加—降低的模式，破土64 h后表達(dá)量基本保持不變，而正常株高品種129則在破土64 h以前表現(xiàn)為下降，64 h以后快速上升，72 h達(dá)到峰值隨后又迅速下降到與矮化突變體D0462幾乎一致的水平（圖2-c）。

圖1 Cs-EXPA2基因的擴(kuò)增結(jié)果M，DL2000kb；1，D0462。

圖2 Cs-EXPA2在黃瓜下胚軸、根、子葉中的表達(dá)

Cs-EXPA2在矮化突變體子葉中的表達(dá)量與正常株高品種在破土64 h前差異不明顯，但在破土后64～72 h正常株高品種Cs-EXPA2的表達(dá)量要明顯大于矮化突變體，可以認(rèn)為子葉在破土后64～72 h細(xì)胞生長(zhǎng)膨脹的速度最快。

3 結(jié)論與討論

膨脹素含量的增加或減少會(huì)影響植物生長(zhǎng)，已經(jīng)證實(shí)膨脹素基因的過(guò)量表達(dá)會(huì)加快轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)（陳愛(ài)國(guó)和陳進(jìn)紅，2003；孫涌棟 等，2008）。而膨脹素基因的表達(dá)量也確實(shí)對(duì)植株的生長(zhǎng)有一定的作用，本試驗(yàn)中黃瓜矮化突變體Cs-EXPA2基因在大多時(shí)間的表達(dá)量都小于正常株高品種，而在相同時(shí)間內(nèi)，矮化突變體的下胚軸也始終短于正常株高品種129，此結(jié)果與孟婧等（2009）的研究結(jié)果一致。

膨脹素基因的表達(dá)具有時(shí)空差異，在不同組織或同一組織不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量各不相同（Cosgrove & Li，1993）。Harrison等（2001）在研究果實(shí)發(fā)育機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同的膨脹素基因在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中存在高-低-高，低-高-低和逐漸增加等3種不同的表達(dá)模式，孫涌棟等（2006）在黃瓜果實(shí)中克隆得到的CsExp10基因的表達(dá)模式為“低-高-低”。Cs-EXPA2基因在矮化突變體D0462與正常株高品種129的下胚軸中的表達(dá)模式均為“低-高-低”，而在根中的表達(dá)模式為“高-低-高”，子葉中的表達(dá)模式大體為“低-高-低”。但D0462與129下胚軸和子葉中Cs-EXPA2表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間不同，根中Cs-EXPA2表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間卻相同。這可能是由于基因的時(shí)空表達(dá)差異導(dǎo)致了材料表型上的差異，但Cs-EXPA2到底起到了何種作用還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)。

已有研究證明，黃瓜植株株高是由單基因體系和多基因體系共同決定的（孫小鐳 等，1990），膨脹素基因是一個(gè)多基因家族，包括EXPA、EXPB、EXLA和EXLB，每個(gè)家族又有多個(gè)亞家族，其中EXPA家族含有12個(gè)亞家族（Sampedro et al.，2006）。家族中不同成員可能參與了不同的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程（Shin et al.，2005），此前對(duì)Cs-EXPA2同一亞家族的Cs-EXPA1的研究發(fā)現(xiàn)，Cs-EXPA1在不同組織的表達(dá)量與本試驗(yàn)中 Cs-EXPA2并不完全相同，其時(shí)空表達(dá)量也有一些差異（另文待發(fā)表），這也說(shuō)明了即使同一亞家族的成員其功能也會(huì)有差異。由此推斷Cs-EXPA2單個(gè)基因的影響不能決定植物的矮化，應(yīng)該是家族成員共同協(xié)作的結(jié)果。單純一個(gè)基因的缺失或者表達(dá)量的降低并不是植物矮化的決定因素，但可能起到了某種積極的作用。

陳愛(ài)國(guó)，陳進(jìn)紅.2003.Expansin 的研究進(jìn)展.植物學(xué)通報(bào)，20（6）:752-758.

孟婧，李鳳蘭，孫莉莉，李成雁，胡寶忠.2009.矮化黃瓜幼苗對(duì)外源GA處理的生理反應(yīng).東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，40（11）:60-64.

孫小鐳，鄔樹(shù)桐，宋緒峨.1990.中國(guó)矮生刺黃瓜品系特性研究初報(bào).園藝學(xué)報(bào)，17（1）:59-64.

孫涌棟，張興國(guó)，杜小兵，蘇成剛，畢喜紅.2006.黃瓜擴(kuò)張蛋白基因CsEXP10的克隆與表達(dá).植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，32（3）:375-380.

孫涌棟，張興國(guó)，羅未蓉，李新崢，劉遵春.2008.黃瓜果實(shí)擴(kuò)張蛋白基因克隆與分析.西北植物學(xué)報(bào)，28（2）:233-236.Cho H T，Cosgrove D J.2002.Regulation of root hair initiation and expansin gene.The Plant Cell，14:3237-3253.

Cosgrove D J，Li Z C.1993.Role of expansin in cell enlargement of oat coleoptiles.Plant Physiology，103:1321-1328.

Cosgrove D J.2000.Loosening of plant cell walls by expansins.Nature，407:321-326.

Fleming A J，McQueen-Mason S，Mandel T.1997.Induction of leaf primordial by the cell wall protein expansin.Science，276:1415-1418.

Harrison E P，McQueen-Mason S，Manning K.2001.Expression of six expansin genes in relation to extension activity in developing strawberry fruit.Journal of Experimental of Botany，52（360）:1437-1446.

Kenneth J，Livak，Thomas D，Schmittgen.2001.Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and the2-△△ctmethod.Methods，25:402-408.

McQueen-Mason S J，Durachko D M，Cosgrove D J.1992.Two endogenous proteins that induce cell expansin in plant.Plant Cell，4:1425-1433.

Pezzotti M，F(xiàn)eron R，Mariani C.2002.Pollination modulates expression of the PPAL gene，a pistil-specific β-expansin.Plant Mol Biol，

49（2）:187-197.

Rose J K，Lee K C，Bennett H H.1997.Expression of a divergent expansin gene is fruit-specific and ripening-regulated.Proc Natl Acad Sci，94（11）:5955-5960.

Sampedro J，Carey R E，Cosgrove D J.2006.Genome histories clarify evolution of the expansin superfamily:new insights from the poplar genome and pine ESTs.Journal of Plant Research，119:11-21.

Shin J H，Jeong D H，Park M C，An G.2005.Characterization and transcriptional expression of the α-expansin gene family in rice.Molecules and Cells，20:210-218.

Wu Y J，Cosgrove D J.2000.Adaptation of roots to low water potentials by changes in cell wall extensibility and cell wall proteins.J Exp Bot，

51:1543-1553.

Cloning and Expression Analysis of Expansion Cs-EXPA2 Gene in Dwarf Cucumber

WANG Duo-jia, HUANG Sha-sha, LI Feng-lan, LI Jin-yang, HU Bao-zhong*
（Life Science College of Northeast Agricultural University, Harbin150030, Heilongjiang, China）

In this study, we cloned an expansion gene Cs-EXPA2 from dwarf cucumber（Cucumis sativus L.）D0462 by RT-PCR. We quantitatively detected its expression in hypocotyls, roots and cotyledons within88 h during cucumber seedling stage by Real-time PCR. The result shows that the level of its expression may be related to the state of cell growth and division in these sites, and the expression level shows obvious differences at different growth stages. The express quantity of Cs-EXPA2 changes along with temporal and spatial variation. The expression pattern of Cs-EXPA2 in hypocotyls is‘low-high-low’, and the expression pattern in roots is‘high-low-high’.

Dwarf cucumber; Expansion; Cs-EXPA2; Clone; Real-time PCR

S642.2

A

1000-6346（2011）02-0044-04

2010-07-27；接受日期:2010-09-13

黑龍江省自然科學(xué)基金（230340），教育部博士后科研基金（200802240008）資助

王多佳，女，博士研究生，專業(yè)方向:植物學(xué)，E-mail:wduojia2009@163.com

*通訊作者（Corresponding author）:胡寶忠，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向:植物學(xué)，E-mail:bzhu@neau.edu.cn