苗明軍 李成瓊 司 軍 任雪松 宋洪元

（1西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，四川成都 610066）

結(jié)球甘藍(lán)西園4號(hào)種子純度的SSR鑒定

苗明軍1，2李成瓊1*司 軍1任雪松1宋洪元1

（1西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，四川成都 610066）

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)結(jié)球甘藍(lán)西園4號(hào)及其親本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，從90對(duì)SSR引物中篩選出1對(duì)具有雙親條帶差異明顯的引物O112-G04，構(gòu)建了清晰的DNA擴(kuò)增指紋圖譜，并對(duì)西園4號(hào)種子進(jìn)行了純度鑒定，與田間形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果高度一致，種子純度均為96.7 %。結(jié)果表明，利用這對(duì)引物對(duì)結(jié)球甘藍(lán)西園4號(hào)種子的純度鑒定是可行的。

結(jié)球甘藍(lán)；SSR標(biāo)記；純度鑒定

結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea L. var. capitata L.）是我國(guó)重要的蔬菜作物之一。西園4號(hào)是利用自交不親和系配制的秋甘藍(lán)一代雜種，在西南地區(qū)栽培面積較大。由于制種過(guò)程中管理措施不當(dāng)和自交不親和性本身的缺陷常會(huì)產(chǎn)生自交種子，即假雜種。純度不高的種子會(huì)對(duì)生產(chǎn)造成很大損失，因此，對(duì)甘藍(lán)種子進(jìn)行純度鑒定是非常必要的。形態(tài)學(xué)鑒定受周期長(zhǎng)、成本高、環(huán)境條件等因素制約。

分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展為種子的純度鑒定提供了一種更為快速、高效的方法（方宣鈞 等，2000；Yashitola et al.，2002）。SSR分子標(biāo)記信息含量高，重復(fù)性好，廣泛、隨機(jī)、均勻地分布于整個(gè)基因組，呈共顯性遺傳，利用雜交種雙親在一些SSR標(biāo)記位點(diǎn)的差異，可以將具有父母本互補(bǔ)帶型的雜交種與其雙親、甚至一些異源花粉造成的雜交種區(qū)分開(kāi)（李召華 等，2006）。目前，RAPD標(biāo)記（莊木 等，1999）和 AFLP標(biāo)記（田雷 等，2001）在甘藍(lán)種子純度鑒定方面已有應(yīng)用，SSR標(biāo)記在甘藍(lán)種子純度鑒定中鮮見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建西園4號(hào)及親本DNA指紋圖譜，篩選出共顯性引物，建立快速、穩(wěn)定的SSR分子標(biāo)記種子純度檢測(cè)技術(shù)體系，并與田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，為甘藍(lán)雜交種純度鑒定提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

雜交種:西園4號(hào)，小區(qū)隔離制種，親本:母本E1，父本C1，均由西南大學(xué)十字花科蔬菜研究所提供。2009年7月在西南大學(xué)十字花科蔬菜研究所實(shí)驗(yàn)基地播種，SSR標(biāo)記鑒定在西南大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。DNA提取采用CTAB方法（王掌軍和馬駿，2008），并加以改良。甘藍(lán)幼苗長(zhǎng)出3～4真葉時(shí)，采用改良后的CTAB方法提取基因組DNA。

本試驗(yàn)按照http://www.uk.crop.net網(wǎng)站上公布的序列合成了90對(duì)甘藍(lán)類(lèi)蔬菜SSR引物，由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成。SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系（司軍 等，2009）為10 μL，1×Buffer（含20.00 mmol·L-1MgCl2），50.00 μmol·L-1dNTPs，模板 DNA（50 ng·μL-1），0.4 UTaqDNA聚合酶（2 U·μL-1），0.4 μmol·L-1SSR引物，1.00 μL DNA，加ddH2O至終體積10 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在Mastercycle gradient梯度PCR儀上進(jìn)行，94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行20個(gè)迫降循環(huán)，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃；再進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用8 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，采用銀染顯色，觀(guān)察并照相記錄。

田間父母本各種植40株，各分兩個(gè)小區(qū)，西園4號(hào)種植60株，分3個(gè)小區(qū)。西園4號(hào)單株掛牌編號(hào)，分別在苗期、結(jié)球期進(jìn)行形態(tài)學(xué)調(diào)查。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間種子純度鑒定

田間調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，父母本分別在苗期和結(jié)球期各調(diào)查40株，異形株率為0。雜交種西園4號(hào)在苗期調(diào)查60株，異形株率為0；結(jié)球期調(diào)查發(fā)現(xiàn)有2株為異形株，異形株率為3.33 %，雜交種西園4號(hào)的純度為96.7 %。異形株的編號(hào)分別為8號(hào)植株和25號(hào)植株。8號(hào)植株與母本性狀一樣，葉柄短、蠟質(zhì)厚、縱橫徑較小、葉球偏小、內(nèi)縮短徑短。25號(hào)植株與父本表型性狀一樣，葉色灰綠、蠟質(zhì)厚、縱橫徑大、葉球偏大、內(nèi)縮短徑長(zhǎng)。

2.2 SSR標(biāo)記種子純度鑒定

2.2.1 DNA提取與檢測(cè) 利用改良CTAB方法提取的 DNA經(jīng)0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和采用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定樣品濃度，OD值均在1.8～2.0之間，瓊脂糖電泳條帶清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象（圖1）。說(shuō)明所提取的 DNA純度高、質(zhì)量好。

2.2.2 特征型引物的篩選 引物的篩選是SSR標(biāo)記進(jìn)行雜交種純度鑒定的一個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)前提。本試驗(yàn)利用SSR標(biāo)記技術(shù)在90對(duì)引物中篩選出22對(duì)多態(tài)性引物，共擴(kuò)增出92條清晰、可重復(fù)性條帶，每對(duì)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為2～6條。其中69條為具有多態(tài)性的條帶，多態(tài)性百分率為75 %。平均多態(tài)性條帶為3.14條。最后篩選出1對(duì)具有共顯性的引物O112-G04，即能在親本C1和E1之間擴(kuò)增出互補(bǔ)的特異譜帶，譜帶間大小差異明顯，很容易將雜交種與其親本分辨開(kāi)，多次重復(fù)，結(jié)果穩(wěn)定。這對(duì)引物可用于西園4號(hào)種子純度鑒定。引物序列為:（正）CGAACATCTTAGGCCGAATC（反）GGTTAAC CTGCGGGATATTG特征引物篩選如圖2。

圖1 部分甘藍(lán)樣品基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果

2.2.3 純度鑒定 利用篩選出的 SSR引物O112-G04對(duì)60個(gè)西園4號(hào)單株及其父母本進(jìn)行SSR標(biāo)記純度鑒定，從圖3中可以看出，8、25號(hào)植株屬于非真實(shí)雜交種，8號(hào)植株缺少父本特異條帶，與母本擴(kuò)增圖譜一樣，說(shuō)明8號(hào)植株為母本苗，25號(hào)植株缺少母本特異條帶，與父本擴(kuò)增帶型相同，說(shuō)明它是父本苗。西園4號(hào)雜交種純度為96.7 %。田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與SSR標(biāo)記雜交種純度檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明利用SSR標(biāo)記進(jìn)行種子純度鑒定可以準(zhǔn)確反映雜交種的真實(shí)純度。

圖2 引物O112-G04對(duì)西園4號(hào)及其親本的擴(kuò)增結(jié)果

圖3 引物O112-G04在部分西園4號(hào)單株及其親本中的擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)兩種純度鑒定結(jié)果的比較分析發(fā)現(xiàn)，田間形態(tài)學(xué)調(diào)查與SSR標(biāo)記純度鑒定結(jié)果一致，種子純度都是96.7 %。說(shuō)明利用SSR標(biāo)記進(jìn)行純度鑒定可以準(zhǔn)確反映雜交種的真實(shí)純度。西園4號(hào)為秋甘藍(lán)，5月下旬收獲種子，7月上旬用于生產(chǎn)上播種，采用田間形態(tài)學(xué)鑒定種子純度，費(fèi)時(shí)、費(fèi)工，且影響雜交種的及時(shí)銷(xiāo)售和農(nóng)民生產(chǎn)，因此建立一套快速、準(zhǔn)確的種子質(zhì)度檢測(cè)體系是非常必要的。本試驗(yàn)采用的10 μL SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系與25 μL RAPD、AFLP體系相比成本較低。采用SSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行雜交種純度鑒定實(shí)質(zhì)是檢測(cè)雜交種及其親本基因組DNA的差異，檢測(cè)所需時(shí)間短，對(duì)DNA的質(zhì)量要求不高，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，不受環(huán)境等因素的限制。

本試驗(yàn)利用SSR標(biāo)記篩選出穩(wěn)定的O112-G04引物，構(gòu)建了西園4號(hào)及其親本的DNA指紋圖譜，其鑒定結(jié)果與田間純度鑒定結(jié)果一致，利用SSR標(biāo)記建立的快速種子純度檢測(cè)體系鑒定甘藍(lán)種子純度是可行的，為辨別和鑒定假冒偽劣種子提供科學(xué)依據(jù)。

方宣鈞，劉思衡，江樹(shù)業(yè).2000.品種純度和真?zhèn)蔚腄NA分子標(biāo)記及其應(yīng)用.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，（2）:106-110.

李召華，朱克永，陳祖武，詹慶才.2006.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在雜交水稻種子純度鑒定中的應(yīng)用.雜交水稻，21（4）:11-14.

司軍，李成瓊，宋洪元，任雪松，宋明，王小佳.2009.結(jié)球甘藍(lán)SSR檢測(cè)體系的建立及優(yōu)化.中國(guó)蔬菜，（12）:19-23.

田雷，曹鳴慶，王輝，郭晶心，周乃元，孫江，賈希海.2001.AFLP標(biāo)記技術(shù)在鑒定甘藍(lán)種子真實(shí)性及品種純度中的應(yīng)用.生物技術(shù)通報(bào)，（3）:38-40.

王掌軍，馬駿.2008.甜瓜基因組DNA的提取及質(zhì)量檢測(cè).寧夏農(nóng)林科技，（3）:29-30.

莊木，王曉武，楊麗梅，劉玉梅，孫培田，方智遠(yuǎn).1999.利用RAPD方法鑒定兩個(gè)春甘藍(lán)品種的純度.中國(guó)蔬菜，（5）:8-9.

Yashitola J，Thirumurugan T，Sundara R M，Naseerullah M K，Ramesha M S，Sarma N P，Sonti Ramesh V.2002.Assessment of purtity of rice hybrids using microsatellite and STS markers.Crop Science，42（4）:1369-1373.

Identification of Cabbage‘Xiyuan No.4’Seed Purity by SSR Markers

MIAO Ming-jun1,2, LI Cheng-qiong1*, SI Jun1, REN Xue-song1, SONG Hong-yuan1
（1College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Key Lab in Olericulture of Chongqing,Key Lab of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing400715, China;2Horticulture Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences Chengdu610066, Sichuan, China）

Cabbage（Brassica oleracea L. var. capitata L.）‘Xiyuan No.4’and its parent were analyzed by SSR molecular marker technology. A primer, with obvious different bands parent, O112-G04 was screened from90 pairs of SSR primers. The DNA fingerprinting of cabbage‘Xiyuan No.4’was constructed, and its seed purity was identified. The result is consistent with those obtained in the field tests. The seed purity was96.7 %.This result shows that it is reliable to use this pair of SSR primer to identify cabbage‘Xiyuan No.4’seed purity.

Cabbage; SSR marker; Purity test

S635.1

A

1000-6346（2011）02-0053-03

2010-06-25；接受日期:2010-10-09

重慶市科委攻關(guān)項(xiàng)目（CSTC,2010AA1023），農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2009F10010355），西南大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目（SWUB2008058），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資金項(xiàng)目（XDJK2010C068，XDJK2010C069）

苗明軍，男，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向:蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)，E-mail:miaomingjun11@126.com

*通訊作者（Corresponding author）:李成瓊，教授，專(zhuān)業(yè)方向:蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)，E-mail:chqli@swu.edu.cn