王 紅,劉吉文,張曉華

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室,山東青島266003)

黃海冷水團(tuán)可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性研究

王 紅,劉吉文,張曉華＊＊

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室,山東青島266003)

本文研究了2008年7月黃海冷水團(tuán)海域可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性。AODC和DVC計數(shù)總菌數(shù)和活菌數(shù)分別為(1.3～4.8)×105/mL和(0.6～1.6)×105/mL;2216E平板以菌落計數(shù)法可培養(yǎng)細(xì)菌濃度為(0.56～2.2)×103cfu/mL。從分離到的475株中選取163株進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增,并用HhaⅠ酶進(jìn)行ARDRA(擴(kuò)增性rDNA限制酶切片段分析)多態(tài)性分析,取114株不同帶型測序。結(jié)果顯示,冷水團(tuán)細(xì)菌歸為4個細(xì)菌類群:變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes),共24個屬,其中包括α-,β-,γ-變形菌綱;非冷水團(tuán)細(xì)菌也歸為這4個門類,共15個屬,但未分離到β-變形菌綱。γ-變形菌綱在冷水團(tuán)和非冷水團(tuán)區(qū)域的不同深度都是優(yōu)勢菌群,不同的是冷水團(tuán)區(qū)域α-變形菌綱比例較高(26.8%),而非冷水團(tuán)區(qū)域α-變形菌綱比例相對較低(15.6%)。這表明黃海冷水團(tuán)和非冷水團(tuán)區(qū)域細(xì)菌多樣性都很豐富,但其群落組成和優(yōu)勢菌群有所不同。此外,16S rDNA測序結(jié)果表明,6株細(xì)菌可能為海洋細(xì)菌新種。

可培養(yǎng)細(xì)菌;多樣性;16S rDNA分析;黃海冷水團(tuán)

黃海冷水團(tuán)(Yellow Sea Cold Water Mass,YSCWM)是我國陸架淺海上1個重要的海洋現(xiàn)象,多年來一直為我國海洋學(xué)家所關(guān)注[1-2]。7～8月,冷水團(tuán)達(dá)鼎盛期,9月以后,隨垂直混合逐漸加深而消失。其主要特征是溫度低且溫差大,鹽差小,溫度變化范圍通常約為5～12℃,鹽度變化范圍通常約為31.5～32.5。黃海冷水團(tuán)是由冬季進(jìn)入黃海的外海水與沿岸水混合而成,并因海面的冷卻作用而下沉到深底層,冬季呈垂直均勻狀態(tài)[3-5]。

ARDRA(Amplified rDNA restriction analysis,擴(kuò)增性rDNA限制酶切片段分析)是基于不同種群16S rDNA序列的差異,用限制性內(nèi)切酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切,然后進(jìn)行凝膠電泳分離,每種微生物可得到特異酶切指紋圖譜,以此來區(qū)分是否屬于同一種微生物[6]。16S rDNA序列分析主要是基于已建立的基因序列數(shù)據(jù)庫,用于確定細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及未知菌的鑒定,目前已被廣泛應(yīng)用于海洋微生物多樣性的研究[7]。本研究利用ARDRA對平板分離得到的黃海冷水團(tuán)和非冷水團(tuán)細(xì)菌進(jìn)行聚類,然后對不同帶型的細(xì)菌用16S rDNA序列分析進(jìn)行鑒定,分析比較了冷水團(tuán)和非冷水團(tuán)可培養(yǎng)微生物的群落組成和優(yōu)勢菌群,一方面有助于了解冷水團(tuán)的存在對微生物多樣性產(chǎn)生的影響,另一方面可以豐富我國海洋微生物菌種庫的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2008年7月21～2008年8月2日隨中國科學(xué)院海洋研究所和青島市科技局聯(lián)合資助的“2008年中國近海海洋科學(xué)考察開放航次”出海采集海水樣品,該航次由中國科學(xué)院海洋研究所的“科學(xué)三號”考察船執(zhí)行。采樣站如圖1所示。采樣點的物理、化學(xué)信息如表1。分別在3500-5,3600-6,3600-8,3400-6和3800-2站點(冷水團(tuán)區(qū)域)以及3200-3和3850-5站點(非冷水團(tuán)區(qū)域),取0,10,30 m深度的海水,同時在3500-5、3600-6和3400-6站點也取了60 m深度海水,用CTD采水器采集海水樣品。取原樣、1/10和1/100 3個稀釋度各100μL在2 h之內(nèi)涂布2216E平板。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

2216E培養(yǎng)基:蛋白胨5 g,酵母膏1 g,FePO4微量,瓊脂20 g,海水1 000 mL,p H=7.6～7.8,121℃滅菌20 min。

試劑均為分析純產(chǎn)品,限制性內(nèi)切酶、PCR試劑等均購自TaKaRa公司。

圖1 采樣站位Fig.1 Map of sampling stations

表1 采樣站位的物理、化學(xué)信息Table 1 Physical and chemical information of sampling stations

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)菌計數(shù)及可培養(yǎng)細(xì)菌的分離純化

(1)海水中細(xì)菌總數(shù)的測定用吖啶橙染色直接計數(shù)法(AODC)[8]測定。取一定量水樣(1 mL),用吖啶橙(4～7滴)染色(3～5 min),用伊拉克黑預(yù)染的孔徑為0.25μL的濾膜抽濾,將濾膜置于熒光顯微鏡下檢測,隨機(jī)計數(shù)至少10個視野,換算出樣品中所含的細(xì)菌數(shù)量。

(2)海水中活菌數(shù)測定用活菌直接鏡檢計數(shù)法(DVC)[9]測定。吸取1 mL海水樣品到1.5 mL的EP管中,向管中加入0.01 mL 0.2%萘啶酮酸和0.01 mL 2.5%酵母膏溶液,混合均勻后,將EP管放入28℃溫箱中培養(yǎng)6 h之后,取出EP管加入0.05 mL甲醛固定水樣。然后按AODC法用吖啶橙染色,熒光顯微鏡計數(shù)。視野中那些長大或變粗的發(fā)橙紅色熒光的是活菌。

(3)平板計數(shù)及分離培養(yǎng)。用無菌海水對樣品進(jìn)行10倍系列稀釋,涂布2216E瓊脂平板,每個樣品涂布3個平板,每個平板涂布0.1 mL稀釋液,在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d進(jìn)行計數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)等特征挑取不同菌落,在2216E平板上劃線純化,每個菌落純化至少2次。用4.5 mL滅菌保種液(85%生理鹽水+15%甘油)將分離純化的菌株保存于-80℃的超低溫冷凍箱中。

1.3.2 DNA提取 根據(jù)菌落的大小、顏色、透明度、邊緣是否規(guī)則、濕潤或干燥、菌落突起、凹陷或平坦等指標(biāo)選取特征不同的菌株用酚-氯仿法進(jìn)行基因組DNA的提取。方法參考Ausubel等[10]。

1.3.3 16S rDNA擴(kuò)增 擴(kuò)增引物:上游引物27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;下游引物1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3’。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min;55℃退火1 min 30 s; 72℃延伸1 min,30個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,點樣量為5μL。

1.3.4 ARDRA分析 將PCR產(chǎn)物用HhaⅠ進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系如下:10×Buffer 1μL、HhaⅠ1.5 μL、16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物5μL、雙蒸水7.5μL,使反應(yīng)體系為15μL。37℃水浴2 h。酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠50V電泳1 h檢測。

1.3.5 16S rDNA序列測定及構(gòu)建系統(tǒng)樹 根據(jù)ARDRA結(jié)果將所有的菌株進(jìn)行歸類,將各大類菌株的16S rDNA PCR產(chǎn)物送上海博尚生物公司進(jìn)行測序,將測得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行相似性比較,用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。將獲得的16S rDNA序列提交GenBank,并獲得序列號。

2 結(jié)果與分析

2.1 海水樣品細(xì)菌計數(shù)

冷水團(tuán)3個站點不同深度海水樣品中,每毫升海水中的總菌數(shù)、活菌數(shù)及可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)目如表2所示。總菌數(shù)為(1.3～4.8)×105/mL,活菌數(shù)為(0.6～1.6)×105/mL,可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)為(0.56～2.2)×103cfu/mL,活菌的比例為33.3%～46.1%。

表2 黃海冷水團(tuán)3個站點海水樣品細(xì)菌計數(shù)Table 2 Enumeration of bacteria in seawater of 3 stations inter of YSCWM

2.2 細(xì)菌菌株DNA的提取和PCR擴(kuò)增

分別從冷水團(tuán)3500-5站點挑選51株菌,3600-6站點19株菌,3600-8站點18株菌,3400-6站點19株菌, 3800-2站點9株菌,非冷水團(tuán)3200-3站點27株菌,3850-5站點20株菌提取的DNA電泳可見清晰的總DNA條帶,獲得的提取物經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳均能得到約1.5 kb的單一條帶(見圖2),表明擴(kuò)增產(chǎn)物無明顯非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。下圖為部分菌株16S rDNA擴(kuò)增圖譜。

圖2 部分菌株16S rDNA PCR條帶圖譜Fig.2 16S rDNA PCR electrophoresis for part of strains

2.3 細(xì)菌菌株ARDRA分析

將這163株菌的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)HhaⅠ酶切,不同站點分離的菌株所獲得的帶型數(shù)見表3。部分菌株的酶切圖譜見圖3,可以看出每個菌株的帶型都在7種以上,說明HhaⅠ酶酶切條帶較多,有較高的分辨率。菌株WH120和WH113 2種酶切帶型在酶切條帶圖中非常常見(見圖3),通過鑒定它們分別是γ -變形菌綱的交替單胞菌屬(A lteromonas)和假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas),從而證明了海水中γ-變形菌綱占優(yōu)勢。

表3 不同站點水樣分離的菌株數(shù)和ARDRA帶型數(shù)Table 3 Numbers of strains isolated from different stations and numbers of ARDRA patterns

2.4 冷水團(tuán)和非冷水團(tuán)區(qū)域菌株的多樣性比較

7個站點每個帶型各取1-2株代表菌株共114株進(jìn)行測序,將獲得的序列運用Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較,獲得菌株的分類地位。冷水團(tuán)和非冷水團(tuán)海水分離菌株所屬類群見表4。114株細(xì)菌的序列均已提交GenBank,獲得的序列號為FJ866642-FJ866748和FJ847830-FJ847836。

分別選取冷水團(tuán)和非冷水團(tuán)區(qū)域的部分菌株,與GenBank數(shù)據(jù)庫中相似性較高的序列建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,見圖4、圖5。

根據(jù)比對結(jié)果,黃海冷水團(tuán)區(qū)域5個站點的82個測序菌株分布在4個細(xì)菌類群:變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、硬壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)(見表4和圖4),共24個屬,其中變形菌門的菌數(shù)最多,其中γ-變形菌綱47株,9個屬;α-變形菌綱22株,8個屬;β-變形菌綱3株,3個屬;硬壁菌門6株,2個屬;放線菌門2株,1個屬;擬桿菌門1株,1屬。非冷水團(tuán)32株測序的菌株也有4個細(xì)菌類群:變形菌門、放線菌門、硬壁菌門和擬桿菌門(見表4和圖5),同樣主要由變形菌門的細(xì)菌構(gòu)成,共15個屬,其中γ-變形菌綱21株,8個屬;α-變形菌綱5株,4個屬;硬壁菌門占有4株,1個屬;放線菌門和擬桿菌門各1株,1屬。細(xì)菌種類比非冷水團(tuán)區(qū)域多。擬桿菌門在冷水團(tuán)分離到的1株菌為黃桿菌綱(Flavobacteria),非冷水團(tuán)分離到的為鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)。以上均說明冷水團(tuán)區(qū)域和非冷水團(tuán)區(qū)域細(xì)菌多樣性都很豐富,但其群落組成有所不同。

圖3 部分菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物HhaⅠ限制性酶切條帶Fig.3 Parts of RFLP patterns derived from the digestion of 16S rDNA PCR products byHhaⅠ

表4 冷水團(tuán)和非冷水團(tuán)海水分離菌株所屬類群Table 4 Taxonomy position of strains isolated from inter and exterior of YSCWM

2.5 不同深度海水中細(xì)菌多樣性比較

7個站點不同深度海水分離菌株所屬類群見表5, γ-變形菌綱在不同深度海水中都是優(yōu)勢菌群,然而不同深度海水中其他菌群的分布有所差異:表層海水(0 m)中α-變形菌綱的種類數(shù)量較多;中層海水(10 m),厚壁菌門有較高的豐度;深層海水(60 m)中除了γ-變形菌綱外,優(yōu)勢菌群不明顯,α-變形菌綱、β-變形菌綱,硬壁菌門和擬桿菌門均有分布。

表5 7個站點不同深度海水分離菌株所屬類群Table 5 Taxonomy position of strains isolated from different depths of seven stations/m

冷水團(tuán)變形菌門包括α-,β-,γ-變形菌綱(見表4),其中β-變形菌綱分離自3500-5站點10,60 m深處。β-變形菌綱包括3個屬Achromobacter(無色菌屬), Delf tia(戴爾福特氏菌屬)和L imnobacter(湖沼桿菌屬)。而非冷水團(tuán)區(qū)域沒有分離到β-變形菌綱。冷水團(tuán)區(qū)域特有的3個屬為Stenotrophomonas(寡養(yǎng)單胞菌屬),A lcanivorax(食烷菌屬)和Oceanobacter(大洋桿菌屬),而非冷水團(tuán)區(qū)域特有的2個屬為A garivorans(食瓊脂菌屬)和Melitea。α-變形菌綱在冷水團(tuán)區(qū)域特有的4個屬為Paracoccus(副球菌屬),Ruegeria(魯杰氏菌屬),Oceanicaulis(大洋柄菌屬)和Phaeobacter(褐桿菌屬),說明冷水團(tuán)區(qū)域α-變形菌綱

圖4 冷水團(tuán)菌基于16S rDNA用Mega 4.0建的Neighbor-joining進(jìn)化樹Fig.4 Neighbor-joining tree showing the relationships between strains isolated from the inter of YSCWM and various reference taxa

圖5 非冷水團(tuán)菌基于16S rDNA用Mega 4.0建的Neighbor-joining進(jìn)化樹Fig.5 Neighbor-joining tree showing the relationships between strains isolated from the exterior of YSCWM and various reference taxa

3 討論

分離海洋微生物常用的培養(yǎng)基有2216E培養(yǎng)基, TCBS培養(yǎng)基(弧菌培養(yǎng)基),海水瓊脂培養(yǎng)基,R2A培養(yǎng)基等。由于不同的微生物所需要的營養(yǎng)不同,任何1種培養(yǎng)基都不能分離培養(yǎng)出所有的海洋細(xì)菌。2216E培養(yǎng)基主要用于分離和培養(yǎng)海洋異養(yǎng)好氧細(xì)菌。本實驗用AODC、DVC和2216E平板計數(shù)法計數(shù)黃海冷水團(tuán)海水中的總菌數(shù)、活菌數(shù)和可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù),實驗結(jié)果顯示活菌的比例為33.3%～46.1%,說明活菌的比例較高,但可培養(yǎng)細(xì)菌的比例較低,因此作者所做的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性與真正的細(xì)菌多樣性仍有差別。

使用ARDRA分析細(xì)菌群落系統(tǒng)發(fā)育,多選取2～5種限制性內(nèi)切酶[11]。使用1種限制性內(nèi)切酶得到的相同帶型菌株,可能會被另一種酶切出不同的帶型。本文使用HhaⅠ酶切,是1種識別四堿基對的限制性內(nèi)切酶,雖然只有1種限制酶切,但此酶分辨率較高,對冷水團(tuán)區(qū)域和非冷水團(tuán)區(qū)域的菌株都有較多的酶切帶型,能顯示出兩者均有較高的微生物多樣性。

1997年P(guān)inhassi等[12]用培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)波羅的海北部沿岸海域浮游細(xì)菌的優(yōu)勢菌群是α-變形菌綱,γ-變形菌綱,β-變形菌綱和擬桿菌門;1999年,Lasse等[13]用PCR-DGGE分析阿拉伯海域的細(xì)菌群落,發(fā)現(xiàn)主要為δ-變形菌綱和放線菌門,并沒有發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱和擬桿菌門;同一年,Christoph等[14]利用同樣的方法研究地中海西部海水,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落組成包括α-變形菌綱,β-變形菌綱和擬桿菌門。可以看出不同海域的細(xì)菌群落組成不同,可能與各自的環(huán)境特征有關(guān)。黃海冷水團(tuán)的微生物群落組成,囊括了α-變形菌綱,γ-變形菌綱,β-變形菌綱,放線菌門和擬桿菌門群落,但是放線菌門,擬桿菌門和β-變形菌綱種類數(shù)量很少,γ-變形菌綱為優(yōu)勢種群。這些差異可能既與海區(qū)有關(guān),也與冷水團(tuán)的生態(tài)特殊性相關(guān)。

劉敏等[15]直接提取黃海冷水團(tuán)水樣混合細(xì)菌的總基因組,利用PCR-DGGE技術(shù)分析了黃海冷水團(tuán)非培養(yǎng)細(xì)菌的群落組成,而本研究采用的是純培養(yǎng)方法,所得到的結(jié)果與他們的結(jié)果有一定的差異。劉敏等[15]沒發(fā)現(xiàn)黃海冷水團(tuán)水樣有α-變形菌綱、放線菌門和厚壁菌門的存在,但發(fā)現(xiàn)有δ-變形菌綱存在,而且劉敏等[15]發(fā)現(xiàn)冷水團(tuán)不同深度水域細(xì)菌群落構(gòu)成與本實驗得到的結(jié)果也有一定的差異。這些結(jié)果說明,雖然非培養(yǎng)方法在某些方面優(yōu)于純培養(yǎng)方法,從理論上來講其得到的細(xì)菌多樣性應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于純培養(yǎng)方法,但是由于多種原因使其結(jié)果具有一定的局限性。比如對混合細(xì)菌的總基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增時,16S rDNA的通用引物經(jīng)常對不同類群的細(xì)菌基因組有不同的親和性,使其不能夠反應(yīng)真正的多樣性。如果需要深入地研究某一特殊區(qū)域的微生物群落多樣性,需要純培養(yǎng)方法與非培養(yǎng)方法相結(jié)合,才能得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

菌株WH020-1,WH063,WH82,WH134, WH169和WH278在使用BLAST進(jìn)行比對時,與最相近菌種的相似性分別為97.6%,97.9%,97.0%, 96.6%,96.2%和96.8%可能為未被鑒定的新種。其中與WH20-1最相近菌株的分類地位為變形菌門,β-變形菌綱,產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae),無色桿菌屬(Achromobacter);與WH63,WH82,WH169和WH278最相近的菌株為同一個菌種,其分類地位為變形菌門,γ-變形菌綱,交替單胞菌科(Alteromonadaceae),海灘桿菌屬(Aestuariibacter);與WH134最相近的菌株為變形菌門,γ-變形菌綱,弧菌科(Vibrionaceae),弧菌屬(Vibrio)。相似性低僅為新菌的一個鑒定標(biāo)尺,為了確定這些菌株是否為新種,還需要做進(jìn)一步的生理生化反應(yīng)鑒定。目前菌株WH169已被鑒定為海灘桿菌屬新種——凝集海灘桿菌(Aestuariibacter aggregatussp.nov.)[16],而WH134已被鑒定為弧菌屬新種——冷水團(tuán)弧菌(Vibriomarisf lavisp. nov.)[17]。

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Abstract: Phylogenetic diversity of cultivable bacteria from the inter of the Yellow Sea Cold Water Mass (YSCWM)area was studied in July 2008,and was compared with that from the exterior of YSCWM area. Sea water samples were collected in five stations 3500-5,3600-6,3600-8,3400-6 and 3800-2 from the inter of YSCWM,and two stations 3200-3 and 3850-5 from the exterior of YSCWM.According to the AODC and DVC results,the total bacterial number and the total number of viable cells of the marine water samples were(1.3～4.8)×105/mL and(0.6～1.6)×105/mL,respectively;from the colony count method with 2216E plates,the abundance of the heterotrophic bacteria of sea water was(0.56～2.2)× 103cfu/mL.475 bacterial strains were isolated from 2216E plates,and the PCR-ARDRA technique was performed on these strains for cluster analysis,with fragments of 16S rDNA digested by restriction enzymeHhaⅠ.The 16S rDNA of all major RFLP patterns were sequenced.Phylogenetic analysis of 114 bacterial strains showed that bacterial phylotypes from the inter of YSCWM were made up of four phyla bacteria,i.e.Proteobacteria,Actinobacteria,FirmicutesandFlavobacteria,including 24 genera,and from the exterior were made up of the same four taxon,including 15 genera.α-,β-andγ-Proteobacteria subdivisions of theProteobacteriawere discovered from the inter of YSCWM.Howeverβ-Proteobacteria was not discovered from the exterior of YSCWM.γ-Proteobacteriarepresented the vast majority of bacterial isolated at every depth.By comparing,α-Proteobacteriarepresented higher proportion with percentage of 26.8%inter of YSCWM and lower proportion with percentage of 15.6%exterior of YSCWM. These indicated that samples from the inter as well as the exterior of YSCWM showed high bacterial diversity,but bacterial community composition,as well as the predominant bacterial groups,from the inter of YSCWM was different from the exterior of YSCWM.In addition,according to the 16S rDNA gene sequences analysis,6 strains might be novel species.

Key words: cultivable bacteria;diversity;16S rDNA analysis;YSCWM

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)

Diversity of Cultivable Bacteria in the Yellow Sea Cold Water Mass

WANG Hong,LIU Ji-Wen,ZHANG Xiao-Hua
(Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding,Ministry of Education,College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Q938.8

A

1672-5174(2011)06-061-07

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2007AA09Z434)資助

2010-05-17;

2010-11-22

王 紅(1984-),女,碩士生,研究方向:海洋微生物學(xué)。

＊＊通訊作者:E-mail:xhzhang@ouc.edu.cn