陳海亭， 尹蓉莉， 陳金玉， 王寶才， 黨萬太， 呂懿平

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都611137)

山楂葉總黃酮(又稱益心酮)，是從山楂葉中提取的黃酮類化合物的總稱，對(duì)心血管疾病有明顯的確切療效［1-3］。目前已有山楂葉總黃酮的中成藥制劑(益心酮系列產(chǎn)品)上市，有益心酮糖衣片、分散片、口服液、軟膠囊、滴丸、注射液、泡騰片、凍干速溶片等［4］，但其有效成分溶解度小而影響吸收使大多數(shù)山楂葉總黃酮普通制劑生物利用度低［5］。本實(shí)驗(yàn)采用增加溶解度調(diào)節(jié)劑的方法［6-8］，改善山楂葉總黃酮的溶解度，從而將其制成微孔滲透泵控釋片，提高其生物利用度，減少每天服用次數(shù)，而達(dá)到作用持久，增加患者順應(yīng)性的目的。同時(shí)為難溶性中藥有效組分滲透泵控釋給藥系統(tǒng)的研究提供一定的參考依據(jù)。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)(central composite designs，CCD)又稱中心組合設(shè)計(jì)，是一種多因素多水平優(yōu)化設(shè)計(jì)，可用三維效應(yīng)面進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及非線性方程擬合，模擬方程可較好的預(yù)測結(jié)果［9］。國內(nèi)常采用正交和均勻設(shè)計(jì)，但兩者均基于線性模型，只能表明某一因素的取值方向而無法求得極值，所以預(yù)測的結(jié)果不夠精確［10］。本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)合效應(yīng)面分析法優(yōu)化山楂葉總黃酮微孔滲透泵控釋片的處方。

1 材料和儀器

蘆丁對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):100080-200707);山楂葉總黃酮提取物(規(guī)格:總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥80%，UV法;購于西安天園生物制劑廠);二醋酸纖維素(國家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乳糖(成都市科龍化工試劑廠);丙酮(成都市科龍化工試劑廠);異丙醇(成都市科龍化工試劑廠);鄰苯二甲酸二乙酯(DBP，成都市科龍化工試劑廠);PEG-400(成都市科龍化工試劑廠);PVP-K30(成都市科龍化工試劑廠);滑石粉(藥用)，其它試劑為分析純。

TDP-I型單沖壓片機(jī) (上海中藥機(jī)械廠);BY-300A型小型包衣機(jī)(上海黃海藥檢儀器廠);UV-1100型紫外分光光度計(jì);ZRS-8G智能溶試驗(yàn)儀(天津天大天發(fā)科技有限公司);BP211D-型電子分析天平(德國Sartorius);BF-200S-WEI型電子天平(德國Sartorius);BUG25-12型超聲波清洗器(必能信超聲上海有限公司);DGG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2．1 山楂葉總黃酮微孔滲透泵控釋片的制備 將山楂葉總黃酮與輔料分別過80目篩。取處方量的山楂葉總黃酮與輔料按等量遞增法混合均勻，然后加入5%的PVP乙醇溶液制軟材，過18目篩制顆粒，40℃烘箱中干燥2 h，然后2號(hào)篩整粒，加入適量的滑石粉混勻壓片，即得片芯。

適量的二醋酸纖維素加入丙酮-異丙醇(100∶3)的混合溶液中，在超聲條件下至完全溶解，然后加入適量的致孔劑PEG-400和增塑劑DBP。將片芯放入包衣鍋內(nèi)，噴霧速度保持在4．5 mL/min，包衣溫度40℃，包衣鍋轉(zhuǎn)速為30 r/min，至包衣膜增重達(dá)到要求即可。

2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取120℃減壓干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品10．25 mg，置50 mL的量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，既得0．205 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液 1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，使混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(附錄V A)，于500 nm的波長處測定吸光度，以質(zhì)量濃度對(duì)吸光度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=0．012 1X －0．004 2(r=0．999 6)說明質(zhì)量濃度與吸光度之間線性關(guān)系良好，線性范圍為8．2 ～49．2 μg/mL。

2．3 釋放度測定方法 取本品，按照《中國藥典》(2010年版二部附錄XC)釋放度測定法第二法:槳法，以500 mL經(jīng)脫氣處理的蒸餾水為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溶出介質(zhì)的溫度為(37±0．5)℃。依法操作，在 2、4、6、8、10、12 h 分別取溶液 5 mL，0．45μm微孔濾膜過濾，并及時(shí)向溶出杯中補(bǔ)充介質(zhì)5 mL。取續(xù)濾液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后同2．2項(xiàng)顯色，以相應(yīng)的試劑為空白，在500 nm的波長處測定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同時(shí)間山楂葉總黃酮的累積釋放度。

2．4 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 預(yù)實(shí)驗(yàn)表明乳糖用量、致孔劑PEG400用量、包衣增重率是影響山楂葉總黃酮滲透泵控釋片釋放的主要因素。因此選擇乳糖用量(X1)，致孔劑用量(X2)，包衣增重率(X3)為考察因素，以山楂葉總黃酮滲透泵控釋片在2、6、12 h的累積釋放度Y2、Y6、Y12為評(píng)價(jià)指標(biāo)做三因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，各因素取5個(gè)水平，用代碼－α、－1、0、+1、+α來表示。對(duì)于三因素星點(diǎn)設(shè)計(jì)α=1．732，在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)定X1范圍:120～240 mg/片;X2范圍:60% ～120%;X3范圍:3%～6%。因素和水平代碼以及實(shí)驗(yàn)安排結(jié)果見表1和表2。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素和水平代碼Tab．1 Variables and codes of composite design

2．5 模型擬合 用 Design-expert7．1．6統(tǒng)計(jì)軟件，以各時(shí)間點(diǎn)累積釋放度為評(píng)價(jià)指標(biāo)分別對(duì)各考察因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合。

多元線性回歸方程:

表2 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)安排及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．2 Factor and response of control com posite design

二項(xiàng)式擬合方程:

從以上擬合方程的相關(guān)系數(shù)可知，多元線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)明顯低于二項(xiàng)式擬合方程的相關(guān)系數(shù)?？梢姸嘣€性回歸擬合度不佳，預(yù)測性較差，因此選擇二項(xiàng)式模型為最佳擬合模型。

2．6 效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測 三維效應(yīng)圖只能表達(dá)兩個(gè)因素和指標(biāo)的函數(shù)關(guān)系，所以固定其中一個(gè)因素，設(shè)為中間值，對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)做三維效應(yīng)圖和等高線(觀察各組因素的三維效應(yīng)圖和等高線可知X3對(duì)Y12的影響顯著。)由圖1和圖2可知，為滿足藥物釋放要求使Y12＞90%，X3取值為3．7，將其代人上述擬合較優(yōu)的二項(xiàng)式方程，采用Design-expert7．1．6軟件繪制X1、X2對(duì)各指標(biāo)的三維效應(yīng)圖和二維等高線圖。見圖3～5。

圖1 X1和X3對(duì)Y12影響的三維效應(yīng)圖及等高線Fig．1 Response surface and contour p lot of Y12 as a function of X1 and X2

圖2 X2和X3對(duì)Y12影響的三維效應(yīng)圖及等高線Fig．2 Response surface and contour plot of Y12 as a function of X2 and X3

圖3 Y2的三維效應(yīng)圖及等高線圖Fig．3 Response surface and contour p lot of Y2

圖4 Y6的三維效應(yīng)圖及等高線圖Fig．4 Response surface and contour p lot of Y5

圖5 Y12的三維效應(yīng)圖及等高線圖Fig．5 Response surface and contour plot of Y12

根據(jù)滲透泵控釋制劑零級(jí)釋放的特性，設(shè)定山楂葉總黃酮滲透泵控釋片各時(shí)間點(diǎn)累積釋放度的區(qū)域，Y2范圍:20% ～30%;Y6范圍:60% ～70%;Y12范圍:＞90%。然后按此要求重疊各指標(biāo)的二維等高線圖，得到能同時(shí)滿足以上條件的最佳區(qū)域。重疊等高線圖見圖6，圖中重疊的白色區(qū)域即為處方的最佳區(qū)域。

圖6 處方優(yōu)化的重疊等高線圖Fig．6 Over lay contour p lot of the optim ixed formu lation

由圖3～5可看出三維效應(yīng)圖均為曲面，說明乳糖用量(X1)和致孔劑用量(X2)和各時(shí)間點(diǎn)的累積釋放度存在非線性關(guān)系。圖1表明隨著乳糖用量(X1)的增大，Y2逐漸減小;隨著孔劑用量(X2)的增大，Y2先逐漸減小，后逐漸增大;圖2說明隨著致孔劑用量(X2)的增大，Y4逐漸增大;圖3說明隨乳糖用量(X1)的增大，Y12先增加后減小;隨著致孔劑用量(X2)的增大，Y12逐漸增大。以上說明乳糖用量(X1)和致孔劑用量(X2)對(duì)不同時(shí)間的藥物釋放的影響不同。

2．7 優(yōu)化處方的驗(yàn)證 在上述最佳區(qū)域內(nèi)選取3個(gè)點(diǎn)作為驗(yàn)證處方進(jìn)行壓片、包衣和釋放度測定。驗(yàn)證處方評(píng)價(jià)指標(biāo)實(shí)際值和預(yù)測值見表3，可知評(píng)價(jià)指標(biāo)的實(shí)際值和預(yù)測值相對(duì)偏差絕對(duì)值均小于5%，說明實(shí)驗(yàn)所得擬合方程可以很好的預(yù)測各因素和評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的關(guān)系。釋放曲線見圖7，可見3個(gè)驗(yàn)證處方釋藥曲線的 R2值分別為0．982 6、0．980 1、0．984 2，說明零級(jí)釋放特性良好。

表3 優(yōu)化處方評(píng)價(jià)指標(biāo)的預(yù)測值和實(shí)測值

圖7 驗(yàn)證處方的釋藥曲線

3 討論

目前國內(nèi)在藥劑處方的優(yōu)化時(shí)多采用正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)，且兩者都是是基于線性模型的設(shè)計(jì)［11］。通常各因素對(duì)效應(yīng)的影響并非呈線性關(guān)，所以正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)的精度不高，建立的數(shù)學(xué)模型的預(yù)測性差［10］。星點(diǎn)設(shè)計(jì)和效應(yīng)面優(yōu)化法是近幾年來國外藥學(xué)工作者常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化法，使用方便，優(yōu)選條件預(yù)測性好［12］，且可用于非線性模型的設(shè)計(jì)。因此本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)合效應(yīng)面法，通過線性和非線性擬合得到最佳擬合方程，繪制三維效應(yīng)面圖和等高線圖，采用重疊等高線圖法［13］，得到最佳處方范圍。

為了得到較好的優(yōu)化結(jié)果，在進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化法之前，應(yīng)保證設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)包括最佳的實(shí)驗(yàn)條件，如果實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的選取不當(dāng)，使用響應(yīng)面優(yōu)化法則不能得到很好的優(yōu)化結(jié)果的。所以在使用響應(yīng)面優(yōu)化法之前，應(yīng)當(dāng)確立合理的實(shí)驗(yàn)因素與水平［12］。所以本實(shí)驗(yàn)首先采用單因素考察篩選出影響藥物的釋放主要因素及其水平范圍，以保證得到較佳的優(yōu)化結(jié)果。

最佳處方范圍的3個(gè)處方評(píng)價(jià)指標(biāo)的實(shí)際值和預(yù)測值的相對(duì)偏差的絕對(duì)值較小，零級(jí)釋放特性明顯，說明實(shí)驗(yàn)所得到的擬合方程可以較好地預(yù)測各因素與評(píng)價(jià)指標(biāo)指標(biāo)的關(guān)系。因此本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化山楂葉總黃酮滲透泵控釋片處方，所得處方符合要求，說明本方法可行。

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