馬小花, 魏玉輝, 王 丹, 武新安*
(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院,甘肅 蘭州730000;2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院,甘肅蘭州730000)
苦參為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根,其性寒,味苦,歸心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng),具有清熱燥濕、殺蟲、利尿之功效,其主要有效成分為苦參堿。目前,提純后的苦參堿單體已經(jīng)在臨床上廣泛用于抗癌、消炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗心律不齊、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、保肝和抗肝纖維化等[1-2]。
探討苦參堿腸道吸收狀況,對于確定臨床合理給藥方案及指導(dǎo)各種制劑的處方設(shè)計(jì),具有重要意義。目前,預(yù)測藥物小腸吸收的方法有體外法、離體法、在體法和體內(nèi)法等[3]。在體法因不損傷研究部位的淋巴和循環(huán)系統(tǒng)而明顯優(yōu)于前兩種方法。其中大鼠單向腸灌流法(in situ rats single pass perfusion model,SPIP)能很好地模擬人體的內(nèi)環(huán)境,以接近生理?xiàng)l件的體積流量(0.2~0.35 mL/min)對一定腸段進(jìn)行單向灌流,從而根據(jù)進(jìn)出口藥物濃度差可方便求得藥物在該腸段的透過性,且結(jié)果與人體的試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性良好,因此在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用[4-5]。
關(guān)于苦參堿在大鼠的腸吸收,已有一些文獻(xiàn)報(bào)道。劉曉紅[1]采用大鼠外翻腸囊和Caco-2細(xì)胞這兩種腸吸收模型對氧化苦參堿和苦參堿的腸吸收特征及吸收動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究;何盛江等[6]用翻轉(zhuǎn)腸囊法研究了苦參堿在小腸的吸收特征,以及不同吸收促進(jìn)劑對苦參堿小腸吸收的影響??紤]到大鼠在體單向腸灌流法由于在實(shí)驗(yàn)過程中不損傷血管和淋巴,藥物透過小腸上皮細(xì)胞后即被血液轉(zhuǎn)運(yùn),能更真實(shí)的反應(yīng)藥物在腸道的吸收情況,而且在腸道中存在大量的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,對藥物的吸收、分布等具有重要的調(diào)控作用[7]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用大鼠在體單向腸灌流模型,以重量法校正凈水流量,考察了不同腸段、藥物濃度、P-gp抑制劑和OCTs抑制劑對苦參堿腸吸收的影響,以揭示苦參堿的腸道吸收機(jī)制,便于使苦參堿能更好的為臨床充分發(fā)揮藥物療效提供理論依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 島津LC-20AT二元梯度泵,SPDM20A二極管陣列檢測器,SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng),DGU-20A在線脫氣系統(tǒng),CTO-20A柱溫箱,LC solution色譜工作站(島津,日本),SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠),XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠),高速離心機(jī)(深圳國華儀器廠),電子天平(北京賽多利斯,LT-224S),蠕動(dòng)泵(上海之信儀器有限公司,DDB-600),電熱恒溫水浴鍋(北京科偉,DXKW-4)。
1.2 試劑與試藥 苦參堿(寧夏紫荊花制藥有限公司,批號 030316,純度 >98.0%,Kerbs-Ringer's 緩沖液(自配,每1 L 含NaCl7.8 g,KCl0.35 g,CaCl20.37 g,NaHCO31.37 g,NaH2PO40.32 g,MgCl220 mg,葡萄糖1.4 g),甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純,去離子水(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院自制)。西咪替丁注射液(武漢安成醫(yī)藥有限責(zé)任公司,批號:H20050711)、維拉帕米注射液(上海禾豐制藥有限公司,批號:H31021343)
1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性 Wistar大鼠16只,體質(zhì)量(260±30)g,購于甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號SCXK(甘)2004-0006.
2.1 灌流液中苦參堿的測定
2.1.1 色譜條件 色譜柱:依利特 Hypersil ODS2(4.6 mm ×150 mm,5 μm);流動(dòng)相為水相(0.05 mol/L磷酸二氫鈉∶0.1%三乙胺)-甲醇(75∶25);檢測波長:210 nm,體積流量:1.0 mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:20μL。在該色譜條件下,苦參堿的出峰時(shí)間在7.5 min,灌腸液及維拉帕米和西咪替丁對其測定無干擾,苦參堿色譜圖見圖1。
圖1 苦參堿HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s ofmatrine
2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,置于10 mL量瓶中,用空白K-R腸灌流液溶解稀釋至刻度,配成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的貯備液,4℃貯藏備用。
精密吸取上述苦參堿貯備液適量,用空白K-R腸灌流液精密配置成質(zhì)量濃度為 3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125、250 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液,按上述色譜條件測定。用峰面積A對質(zhì)量濃度C進(jìn)行回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=27 663C-3 825.2,r=0.999 9
2.1.3 苦參堿在腸灌流液中的穩(wěn)定性 取K-R緩沖液進(jìn)行大鼠在體小腸循環(huán)2 h得空白腸循環(huán)液,以此空白腸循環(huán)液配制高、中、低(250、31.25、3.91 μg/mL)濃度的苦參堿溶液,置37℃水浴中,分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0 h 取樣 100 μL,以 10 000 r/min離心5 min后,吸取20μL進(jìn)樣,測定峰面積。結(jié)果表明,苦參堿在腸循環(huán)液中孵化2 h,其峰面積RSD為0.58%,說明2 h內(nèi)苦參堿在循環(huán)液中能夠保持相對穩(wěn)定。
2.1.4 精密度與準(zhǔn)確度 配制高、中、低(250、31.25、3.91 μg/mL)濃度的苦參堿標(biāo)準(zhǔn)液,于同一天內(nèi)不同時(shí)間重復(fù)測定5次,計(jì)算日內(nèi)精密度;于不同天內(nèi)每日測定1次,連續(xù)測定5 d,計(jì)算日間精密度。結(jié)果測得高、中、低濃度的日內(nèi)精密度和日間精密度均小于2%;高、中、低濃度的準(zhǔn)確度在98% ~102%之間。
2.2 大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)
2.2.1 實(shí)驗(yàn)方法[8-9]實(shí)驗(yàn)前將大鼠禁食16 h(自由飲水),腹腔注射10%烏拉坦(1.0 g/kg)麻醉,固定并維持37℃體溫。沿腹中線打開腹腔,小心分離出待考察腸段,十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸,各取約10 cm于兩端切口插入合適的硅膠管后結(jié)扎,并用沾有生理鹽水的紗布包裹腹部防止脫水。同時(shí)用預(yù)熱至37℃生理鹽水將腸內(nèi)容物輕輕沖洗干凈后用空氣將生理鹽水排凈。將硅膠管連接恒流裝置,換苦參堿灌流液小瓶以體積流量0.2 mL/min灌流,平衡15 min后認(rèn)為達(dá)到穩(wěn)態(tài),此時(shí)迅速換準(zhǔn)確稱質(zhì)量的苦參堿灌流液(20 mL)繼續(xù)灌流,以準(zhǔn)確稱質(zhì)量的具塞小瓶每15 min接取流出液,實(shí)驗(yàn)共收集灌流液7次,灌流完成后剪下被考察的腸段,量取小腸的內(nèi)徑和長度,并將灌流液小瓶和收集液小瓶稱重,以計(jì)算流入腸道的液體量,收集液以10 000 r/min離心5 min后用HPLC測定收集液中苦參堿的濃度。
2.2.2 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)采用重量分析法對灌流液的流入和流出的體積進(jìn)行校正,消除其體積變化的影響,按下列方程式計(jì)算吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀吸收系數(shù)(Papp)。
式中:Vin和Vout分別為腸道進(jìn)、出口灌流液的體積(mL);Cin和Cout分別為腸道進(jìn)、出口灌流液的濃度(μg/mL);Q為灌流速度(mL/min);l和r分別為被灌流腸段的長度和內(nèi)徑(cm)。
2 h藥物吸收量(M),M=X1-X2。X1為灌流前腸循環(huán)液中含藥量,X2為灌流結(jié)束時(shí)腸循環(huán)液中含藥量。
2.2.3 苦參堿在大鼠不同腸段吸收情況 精密配制含400μg/mL的苦參堿灌流液,按照實(shí)驗(yàn)方法分別進(jìn)行十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸灌流,測定灌流液中苦參堿,并計(jì)算吸收參數(shù),其吸收參數(shù)見表1。經(jīng)過方差分析,大鼠各腸段之間有差異。由表1可見,不同腸段的吸收速率常數(shù)依次下降,即空腸>回腸>結(jié)腸>十二指腸。十二指腸與結(jié)腸的吸收速率常數(shù)比較無顯著性差異(P>0.05),空腸段與十二指腸的吸收速率常數(shù)相比,具有明顯差異(P<0.01),與結(jié)腸相比有差異(P<0.05)。而且據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道大鼠 Papp<0.03×10-4cm/s和 Papp>0.2×10-4cm/s時(shí)分別表示藥物難以吸收和易于吸收,由表1可知,各個(gè)腸段的Papp值均大于0.2×10-4cm/s,說明苦參堿在各個(gè)腸段均有吸收,在空腸段的吸收尤為明顯。
表1 不同腸段苦參堿的吸收參數(shù)比較(n=5, ± s)Tab.1 Absorption parameters of matrine in different segment of rat intestine with SPIPmodel(n=5, ± s)
表1 不同腸段苦參堿的吸收參數(shù)比較(n=5, ± s)Tab.1 Absorption parameters of matrine in different segment of rat intestine with SPIPmodel(n=5, ± s)
與十二指腸組比較,**P <0.05;與結(jié)腸組比較,*P <0.05。**P <0.01 vs duodenum;*P <0.05 vs colon.
腸段 Ka×10-2/min Papp×10-3/(cm/min)十二指腸 0.25±0.06** 0.25±0.06**空腸 0.80 ±0.02 0.90 ±0.04回腸 0.40 ±0.14 0.36 ±0.10結(jié)腸 0.35 ±0.10* 0.28 ±0.04*
2.2.4 濃度對苦參堿腸吸收的影響 精密配制含100、200、400 μg/mL 的苦參堿灌流液,根據(jù) 2.2.3項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選大鼠空腸段結(jié)扎,按濃度依次進(jìn)行灌流,藥物的吸收量和吸收速率常數(shù)Ka見表2和圖2。由表2可見,在不同濃度條件下苦參堿的吸收量隨藥物濃度的增大而增大,表觀吸收速率常數(shù)Ka無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。由圖2可知在100~400 μg/mL內(nèi)藥物的吸收量與濃度呈線性關(guān)系,說明苦參堿的濃度對小腸的吸收沒有影響,因此推測苦參堿在大鼠空腸中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)可能是一種被動(dòng)擴(kuò)散過程。
2.2.5 P-gp或OCTs對苦參堿吸收的影響 精密配制含400μg/mL的苦參堿灌流液(內(nèi)含P-gp抑制劑鹽酸維拉帕米100μg/mL或內(nèi)含OCTs抑制劑西咪替丁400 μg/mL),根據(jù)2.2.1項(xiàng)試驗(yàn)方法,選取空腸段分別進(jìn)行灌流,考察苦參堿在空腸的吸收是否受到P-gp和OCTs外排作用的影響,結(jié)果見表3。兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被抑制后苦參堿在空腸段的吸收參數(shù)與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明苦參堿的吸收不受P-gp和OCTs的影響,初步說明苦參堿可能不是P-gp或OCTs的底物。
表2 不同質(zhì)量濃度對苦參堿腸吸收參數(shù)的影響(n=5, ± s)Tab.2 Effect of the concentrations ofmatrine perfusion on their absorption parameters using SPIP model(n=5, ± s)
表2 不同質(zhì)量濃度對苦參堿腸吸收參數(shù)的影響(n=5, ± s)Tab.2 Effect of the concentrations ofmatrine perfusion on their absorption parameters using SPIP model(n=5, ± s)
質(zhì)量濃度/(μg/mL) Ka×10-2/min M/(μg/h)100 0.79 ±0.11 508.79 ±190.63 200 0.81 ±0.09 1 491.22 ±50.16 400 0.80 ±0.02 2 647.82 ±42.40
圖2 3種質(zhì)量濃度對苦參堿吸收量的影響Fig.2 Effect of three concentrations of matrine perfusion on their absorption
表3 P-gp或OCTs抑制劑對苦參堿吸收參數(shù)的影響(n=5, ± s)Tab.3 Effect of P-gp and OCTs inhibitor on the absorption ofmatrine(n=5, ± s)
表3 P-gp或OCTs抑制劑對苦參堿吸收參數(shù)的影響(n=5, ± s)Tab.3 Effect of P-gp and OCTs inhibitor on the absorption ofmatrine(n=5, ± s)
Ka×10-2/min Papp×10-3/(cm/min)苦參堿0.80 ±0.02 0.90 ±0.04苦參堿 +維拉帕米 0.82 ±0.12 0.86 ±0.15苦參堿+西咪替丁0.75 ±0.21 0.80 ±0.26
本實(shí)驗(yàn)采用國際上常用的大鼠在體單向腸灌流模型研究苦參堿的腸吸收,此方法灌流速度接近小腸正常的蠕動(dòng)速度,與口服給藥后藥物接觸的腸道環(huán)境更接近,因此大鼠腸灌流所得的結(jié)果可能與人體有較好的相關(guān)性,而且用重量法校正凈水流量,方法簡便可行,穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好,并且與用酚紅校正的腸灌流法相比,減小了由于酚紅等標(biāo)識物吸收而造成的誤差。
本試驗(yàn)結(jié)果大鼠四個(gè)腸段的Papp值均大于0.2×10-4(cm/s)表明苦參堿在小腸吸收較好,以空腸段的吸收尤為顯著,可考慮將其制成口服的靶向制劑。不同腸段的吸收速率常數(shù)按空腸、回腸、結(jié)腸、十二指腸依次下降,可能是由于空腸和結(jié)腸腸腔內(nèi)藥物的有效吸收表面積比空腸吸收藥物的有效表面積小,而且十二指腸的pH值為5~6,苦參堿作為有機(jī)弱堿性藥物,當(dāng)pH降低時(shí),苦參堿呈解離狀態(tài),不利于吸收。劉曉紅[1]用離體的外翻腸囊法和Caco-2細(xì)胞對苦參堿的腸吸收研究顯示苦參堿的腸吸收主要為經(jīng)細(xì)胞通路被動(dòng)擴(kuò)散吸收,且不受P-糖蛋白外排蛋白的影響,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致;而何盛江等[6]用翻轉(zhuǎn)腸囊法研究苦參堿在空腸、十二指腸、回腸吸收速率沒有顯著性差異(P>0.05),可能與本實(shí)驗(yàn)采用的方法不同有關(guān)。
P-糖蛋白和有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是兩種重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,對大部分藥物的生物利用度和組織分布有重要的調(diào)控作用。P-gp在空腸、遠(yuǎn)端回腸、結(jié)腸表達(dá)依次增加。作為P-gp的底物通常需要既具有脂溶性又具有水溶性,同時(shí)在生理pH下化合物呈陽離子,如已知的底物維拉帕米、喹啉類、吲哚類生物堿等均為陽離子化合物。OCTs在肝臟、腎臟和腸道中均有表達(dá),考慮到OCTs的底物包括許多陽離子化合物,如四乙胺、硫胺、1-甲基-4-苯基吡啶等,而苦參堿屬于喹諾里西丁類生物堿,與OCTs的底物結(jié)構(gòu)相似。為此,本實(shí)驗(yàn)考察了P-gp和OCTs對苦參堿的吸收是否有影響。結(jié)果表明,在灌腸液中分別加入維拉帕米和西咪替丁這兩種抑制劑后,所得的Ka和Papp值與苦參堿直接灌流相比無明顯差異。因此,苦參堿可能不是P-gp和OCTs的底物,P-gp和OCTs可能不參與苦參堿在腸道的吸收。比如在臨床用藥中苦參堿聯(lián)合順鉑化療時(shí)[11],順鉑是P-gp的底物[12],順鉑與苦參堿可能不會(huì)出現(xiàn)影響藥物臨床療效的P-gp分子水平上的競爭性藥物相互作用,從而提高了藥物應(yīng)用的安全性和有效性。
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