石志娜， 周 昕， 梁曉強(qiáng)， 謝瑞芳， 張靜喆

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032)

清膽膠囊是我院研發(fā)的中藥新藥，由我院朱培庭教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來。主要由大黃、虎杖、陳皮等組成，具有清除濕熱、行氣活血、緩下通便和健脾和中之功效［1］，主要用于治療氣郁型慢性膽囊炎、膽結(jié)石、慢性膽管炎、膽管結(jié)石等癥且有一定的預(yù)防作用，有確定的臨床療效［2-4］。方中大黃清泄?jié)駸?、利膽消黃，為君藥;虎杖清熱解毒、利濕活血，兼緩下通便，為臣藥;陳皮行氣，與大黃、虎杖活血作用相配，可奏行氣活血之功效，以達(dá)通則不痛的目的，為使藥［1，5-6］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:清膽膠囊在肝膽水平有顯著的藥理效應(yīng)［7］，如顯著降低成石率，改善與成石相關(guān)的血清及肝臟等生化學(xué)異常［8-9］;明顯降低肝臟、膽汁中 β-葡萄糖醛酸酶活力［8，10］，降低膽汁中游離膽紅素和鈣離子含量逆轉(zhuǎn)成石膽汁，發(fā)揮防治膽色素結(jié)石的作用［1，10］;還可通過上調(diào)肝臟組織中膽石相關(guān)基因B-UGTmRNA和(YPTA)mRNA的表達(dá)，干預(yù)膽紅素和膽固醇代謝，抑制致石性膽汁的形成，從而達(dá)到預(yù)防膽結(jié)石的目的［8，11］;等等。

眾所周知，中藥質(zhì)量控制方法對(duì)中藥的療效至關(guān)重要。選取藥物中的主要有效成分進(jìn)行定量測(cè)定，可以間接的考察中藥的質(zhì)量。因此，本實(shí)驗(yàn)收集3批清膽膠囊，建立清膽膠囊中有效成分的定量測(cè)定方法，以對(duì)清膽膠囊的質(zhì)量進(jìn)行有效的控制。

1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

1．1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(德國(guó)Agilent公司)，由 G1311A色譜泵，G1379A在線脫氣裝置，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱及G1315B兩極管陣列檢測(cè)儀組成;XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);SB2200超聲儀(上海必能超聲儀器公司);AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)等儀器。

1．2 試劑 虎杖苷(批號(hào)111575-200502)、橙皮苷(批號(hào) 110721-200613)、大黃素(批號(hào) 110756-200110)、大黃酚(批號(hào)110796-201017)、大黃素甲醚(批號(hào)110758-200912)等對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(純度＞99%)。HPLC級(jí)甲醇購(gòu)自Merk公司(德國(guó))，水為純化水，由Milli-Q水處理系統(tǒng)處理(Millipore，Bedford，MA，USA)，其他試劑為分析純，購(gòu)自上海吳涇化工廠。

清膽膠囊(080401、090501、100101等 3個(gè)批號(hào))，均為上海上聯(lián)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 實(shí)驗(yàn)條件

2．1．1 色譜條件 色譜柱:ZORBAX XDB-C18990967-902(4．6 mm ×250 mm，5 μm)，以甲醇為流動(dòng)相A，0．1%磷酸水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件見圖1所示，體積流量為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為5μL。

圖1 梯度洗脫中流動(dòng)相變化圖Fig．1 M obile phase variations in gradient elution

2．1．2 對(duì)照品溶液配制 精密稱取虎杖苷1．40 mg、橙皮苷 2．10 mg、大黃素 1．08 mg、大黃酚 0．75 mg及大黃素甲醚1．17mg，于10mL量瓶中，用甲醇定容，然后稀釋至不同濃度，0．22μm微孔濾膜濾過，作為對(duì)照品溶液。

2．1．3 供試品溶液配制 精密稱取清膽膠囊約0．5 g于10 mL量瓶中，加甲醇約至刻度線，超聲提取20 min，冷卻至室溫，補(bǔ)充溶劑至刻度，搖勻，靜置過夜后，取上清液，10 000 r/min，離心 10 min，經(jīng)0．22μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2．2 方法學(xué)考察

2．2．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取虎杖苷、橙皮苷、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚不同濃度的對(duì)照品溶液注入色譜儀，進(jìn)樣量為5μL，按2．1．1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 虎杖苷、橙皮苷、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab．1 The standard curves of polydatin，hesperidin，em odin，chrysophanol and physcion

2．2．2 精密度試驗(yàn) 分別取虎杖苷(140μg/mL)、橙皮苷(213μg/mL)、大黃素(108μg/mL)、大黃酚(75μg/mL)、大黃素甲醚(117μg/mL)對(duì)照品溶液5μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果見表2。

表2 虎杖苷、橙皮苷、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的精密度試驗(yàn)(n=6)Tab．2 The precision tests of polydatin，hesperidin，emodin，chrysophanol and physcion(n=6)

2．2．3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份清膽膠囊按2．1．3項(xiàng)下處理得供試品溶液，在 0、3、6、24、48 h 分別進(jìn)樣5μL，記錄峰面積，主要指標(biāo)成分的RSD結(jié)果見表3。

2．2．4 加樣回收率試驗(yàn) 取同一份清膽膠囊，按高、中、低劑量分別加入虎杖苷、橙皮苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等對(duì)照品，按2．1．3項(xiàng)下處理得供試品溶液，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表3 清膽膠囊穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab．3 The stability tests of Qingdan Capsule

表4 加樣回收率試驗(yàn)Tab．4 The recovery experiments

續(xù)表4

2．2．5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次清膽膠囊，按2．1．3項(xiàng)下平行處理5份供試品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，記錄峰面積，主要指標(biāo)成分的量(以± s形式表示)和RSD結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)Tab．5 The reproducibility experiments

表6 3批次清膽膠囊主要指標(biāo)成分的量Tab．6 Themain index concentrations in Qingdan Capsule of three batches

2．3 樣品測(cè)定 精密稱取3個(gè)批號(hào)清膽膠囊，每個(gè)批次平行3份，按2．1．3項(xiàng)下處理得供試品溶液，注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣量為5μL，按2．1．1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖(見圖2)。同時(shí)將不加入藥材的輔料按2．1．3項(xiàng)下處理得陰性樣品溶液，注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣量為5μL，按2．1．1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖(見圖3)。

圖2 清膽膠囊樣品HPLC圖譜Fig．2 The HPLC chromatogram of Qingdan Capsule

圖3 清膽膠囊陰性樣品HPLC圖譜Fig．3 The HPLC chromatogram of negative sample of Qingdan Capsule

2．4 統(tǒng)計(jì)分析 虎杖苷、橙皮苷、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚等各指標(biāo)成分以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品量(μg)為橫坐標(biāo)，采用回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果和討論

3．1 色譜條件的優(yōu)化 本次研究在HPLC測(cè)定方法摸索過程中，主要通過對(duì)流動(dòng)相比例的改變(梯度洗脫)來使色譜峰分離，試驗(yàn)曾選用甲醇-0．1%磷酸水(80:20)［12-13］，甲醇-0．1%磷酸水(70 ∶30)等甲醇與0．1%磷酸水不同比例的流動(dòng)相，經(jīng)過與圖譜的比較，在多次調(diào)整甲醇與0．1%磷酸水的比例及比例變化時(shí)間點(diǎn)后，最終確定現(xiàn)有色譜條件下，色譜峰能達(dá)到基線分離。

在此條件下，共得到22個(gè)色譜峰，其中包括虎杖苷、橙皮苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5個(gè)成分，保留時(shí)間分別為 62．30 min，72．65 min，127．62 min，131．62 min，138．12 min，其回歸方程的相關(guān)系數(shù)大于0．999 8，表明各化合物在相應(yīng)的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(見表1)。

由于清膽膠囊由大黃、虎杖和陳皮組成，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚為大黃的主要成分，虎杖苷及橙皮苷為虎杖和陳皮的主要成分，均為有效成分，具有一定代表性，因此選用這5個(gè)成分作為清膽膠囊的指標(biāo)成分。

3．2 方法學(xué)結(jié)果表明 這5個(gè)指標(biāo)成分虎杖苷、橙皮苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為 1．80%、2．40%、1．63%、1．26% 和 1．47%，表明儀器精密度良好(見表2);同一供試品在48h內(nèi)，各指標(biāo)成分峰面積保留時(shí)間的RSD小于2%，峰面積的RSD小于5%，表明該色譜條件在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(見表3);虎杖苷、橙皮苷、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的回收率分別為98．92% ～100．22%，97．64% ～ 106．43%，97．26% ～ 107．43%，90．41%～97．03%，105．11% ～ 108．18%，表明回收率良好(見表4);5份平行處理的供試品各指標(biāo)成分的RSD小于10%，說明重復(fù)性較好(見表5);3個(gè)批次清膽膠囊主要指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD在0．95%～9．98%，但是各批次主要指標(biāo)成分量還是有一定差異，說明中藥工藝穩(wěn)定性還有待于提高(見表6)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)清膽膠囊進(jìn)行測(cè)定，建立了定量測(cè)定方法，可以在同一條件下，使20余個(gè)峰得到良好的基線分離，同時(shí)測(cè)定虎杖苷、橙皮苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等5個(gè)指標(biāo)成分的量。進(jìn)一步方法學(xué)研究表明，該色譜方法可靠、穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好，可以考慮作為清膽膠囊的質(zhì)量控制方法。

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