毛阿娟， 王曉雯， 王世祥， 彭 寧， 張亞軍， 鄭曉暉， 劉勤社，*

(1．西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710069;2．陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安710068)

活血膠囊由西安大唐制藥有限公司生產(chǎn)，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血，活血化瘀，理氣安神的作用。該藥選用地道中藥材原料黃芪、紅花、桃仁、枳殼、川芎、當(dāng)歸、赤芍、酸棗仁等多味中藥，主要用于治療氣血虛弱、瘀血阻滯所致的心絞痛、過(guò)敏性紫癜、頸椎病和神經(jīng)衰弱等疾?。?-3］。中藥復(fù)方中羥基紅花黃色素A和柚皮苷定量測(cè)定的報(bào)道較多［4-11］，而活血膠囊中這兩種成分的定量測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道，在前面工作中我們已對(duì)其中芍藥苷、苦杏仁苷、川芎嗪、阿魏酸進(jìn)行了測(cè)定［12］。為了更全面控制藥物質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其中羥基紅花黃色素A、柚皮苷進(jìn)行了測(cè)定。

1 儀器與試劑

Agilent四元高效液相色譜儀(1100系列)，包括:四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和DAD二極管陣列檢測(cè)器;Sartorius BP221S型萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)Sartorius公司);Maxima超純水機(jī)(英國(guó));KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)。

本研究所用的活血膠囊樣品由西安大唐制藥集團(tuán)公司提供。羥基紅花黃色素A對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111637-200905);柚皮苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110722-200610);色譜甲醇(美國(guó)Fisher公司)，其它試劑均為分析純。

2 方法

2．1 色譜條件 色譜柱:Agilent HC-C18色譜柱(4．6 mm ×150 mm，5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng):羥基紅花黃色素A 403 nm，柚皮苷283 nm;流動(dòng)相:甲醇-0．2%甲酸水(羥基紅花黃色素A 20∶80，柚皮苷33∶67);體積流量:0．8 mL/min;柱溫:25℃。

在擬定色譜條件下，羥基紅花黃色素A和柚皮苷與其他組分色譜峰均可基線分離，且分離度＞1．5;羥基紅花黃色素A和柚皮苷的理論塔板數(shù)分別為11 838、39 717;且陰性樣品無(wú)干擾。對(duì)照品，供試品及陰性樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig．1 HPLC chromatograms

2．2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取羥基紅花黃色素A 標(biāo)準(zhǔn)品1．2 mg，柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品1．4 mg，分別置2 mL的量瓶中，用純水超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照品溶液(羥基紅花黃色素A 0．6 mg/mL，柚皮苷0．7 mg/mL)，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2．3 供試品溶液的制備 取活血膠囊樣品，研細(xì)，精密稱取0．3 g，置具塞錐形瓶中，加50 mL純水，密塞超聲處理30 min，放冷，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試品溶液。

2．4 陰性供試品溶液的制備 按活血膠囊生產(chǎn)工藝制備缺紅花、枳殼的陰性制劑，并按照供試品溶液的制備方法制備各陰性供試品溶液。

3 結(jié)果

3．1 線性關(guān)系考察 精密吸取2．2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，將其配成羥基紅花黃色素A質(zhì)量濃度為:1．25、2．5、5、12．5、25、50 μg/mL，柚皮苷質(zhì)量濃度為:8．75、17．5、35、87．5、175、350 μg/mL 的系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液各50μL，按確定的色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果:羥基紅花黃色素 A:Y=12．919X －1．287 8，R=0．999 9;柚皮苷:Y=9．696 7X+12．492，R=1．000。

3．2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液50μL(羥基紅花黃色素A25μg/mL，柚皮苷87．5μg/mL)分別連續(xù)進(jìn)樣5次，羥基紅花黃色素A和柚皮苷峰面積的RSD值分別為1．9%、1．2%，表明其精密度良好。

3．3 重復(fù)性試驗(yàn) 取活血膠囊樣品(批號(hào)20081204)5份，分別按2．3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并進(jìn)行測(cè)定，其峰面積的RSD值分別為1．3%和2．8%，表明樣品重復(fù)性良好。

3．4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液50μL(批號(hào)20081006)，室溫下放置 0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)樣，羥基紅花黃色素A和柚皮苷峰面積的RSD值分別為1．6%和1．9%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3．5 回收率試驗(yàn) 取已知量的活血膠囊樣品(批號(hào)20081006)0．3 g，平行6份，置50 mL量瓶中，分別加入羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液(100μg/mL)和柚皮苷對(duì)照品溶液(400μg/mL)各2 mL，用純水稀釋至刻度，按2．3項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，分別測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1，2。

由表1和2可知，羥基紅花黃色素A和柚皮苷的平均回收率分別為98．7%和99．2%，表明方法回收率良好。

3．6 樣品測(cè)定 按2．3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量均為50μL，每批樣品平行測(cè)定3次，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算羥基紅花黃色素A和柚皮苷量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 羥基紅花黃色素A加樣回收率結(jié)果(n=6)Tab．1 Result of recovery test of hydroxy safflower yellow A(n=6)

表2 柚皮苷加樣回收率結(jié)果(n=6)Tab．2 Result of recovery test of naringin(n=6)

表3 樣品中羥基紅花黃色素A和柚皮苷測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab．3 The contents of hydroxy safflower yellow A and naringin in sample(n=3)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)活血膠囊樣品的提取方法進(jìn)行了考察，比較純水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、以及100%甲醇，結(jié)果純水提取效率較其他高，且成本低，因此我們選擇純水作為活血膠囊的提取溶劑。同時(shí)我們對(duì)提取時(shí)間也進(jìn)行了考察，比較超聲處理20 min、30 min、40 min、50 min，結(jié)果超聲 30 min 得到樣品測(cè)定成分含有量基本達(dá)到最大，因此我們對(duì)樣品超聲提取30 min。

為了同時(shí)測(cè)定羥基紅花黃色素A和柚皮苷，我們首先選擇等度洗脫，但兩物質(zhì)出峰時(shí)間相差太遠(yuǎn)，進(jìn)而采用梯度洗脫，但基線上漂嚴(yán)重;同時(shí)由于樣品中羥基紅花黃色素A和柚皮苷量有限，在同一檢測(cè)波長(zhǎng)下峰面積較小，積分誤差較大，所以最后決定對(duì)兩成分進(jìn)行分別測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同流動(dòng)相也進(jìn)行了比較，如甲醇-水、甲醇-0．2%甲酸水、乙腈-水，結(jié)果顯示采用甲醇-0．2%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)，羥基紅花黃色素A和柚皮苷峰形良好，與周圍峰達(dá)到完全分離，且毒性小成本低，因此我們選甲醇-0．2%甲酸水作為洗脫系統(tǒng)。

［1］田金荷．活血膠囊臨床應(yīng)用及臨床研究［J］．中國(guó)醫(yī)藥指南，2010，8(29):300-301．

［2］魏安偉．活血膠囊治療穩(wěn)定型心絞痛療效觀察［J］．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18(25):3063-3064．

［3］劉月慶，王 睿，畢開(kāi)順，等．HPLC法測(cè)定紅花中羥基紅花黃色素A的含量［J］．藥物分析雜志，2004，24(4):356-358．

［4］陳宗良，朱 克，周 玲，等．HPLC法測(cè)定愈傷靈膠囊中羥基紅花黃色素A的含量［J］．藥物分析雜志，2010，30(2):298-299．

［5］吳 鋒，豆久鋒，陳忠良．HPLC法測(cè)定祛風(fēng)止痛膠囊中羥基紅花黃色素 A［J］．中草藥，2010，41(11):1817-1818．

［6］金 鳴，藏寶霞，李金榮，等．羥基紅花黃色素A熱穩(wěn)定性的初步研究［J］．中國(guó)中藥雜志，2003，28(12):1197．

［7］Wei X B，Liu H Q，Sun X，et al．Hydroxysafflor yellow A protects rat brains against ischemia-reperfusion injury by antioxidant action［J］．Neurosci Lett，2005，386(1):58．

［8］侯劍萍，王春霞．健胃片中柚皮苷的含量測(cè)定［J］．中藥材，2010，33(7):1182-1183．

［9］Ribeiro IA，Ribeiro M H L．Naringin and naringenin determination and control in grapefruit juice by a validated HPLC method［J］．Food Control，2008，19(4):432-438．

［10］崔宇宏，常海萍，史憲海．對(duì)枳殼中柚皮苷含量測(cè)定方法的改進(jìn)［J］．中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6(1):46-47．

［11］王發(fā)英，徐 歡，楊武亮，等．枳殼質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．中成藥，2009，31(12):1897．

［12］王世祥，王曉雯，高志娟，等．HPLC測(cè)定活血膠囊中芍藥苷、苦杏仁苷、川芎嗪及阿魏酸的含量［J］．中成藥，2001，33(4):619-622．