王 碩， 袁經(jīng)權(quán)， 周小雷， 龔小妹， 陳乾平， 繆劍華*

(1．廣西藥用植物研究所姚新生院士重點實驗室，廣西南寧530023;2．廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧5300021;3．暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東廣州510632)

蔓性千斤拔始載于《植物名實圖考》［1］，為瑤族地區(qū)常用藥，稱其為地鉆，為豆科千斤拔屬植物蔓性千斤拔 Flemingiae philippinensis(Merr．et Rolfe)Li的根［2］。廣泛分布于我國云南、四川、貴州、湖南、廣西、廣東、福建和臺灣等地［3］，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、強筋壯骨、消炎止痛、活血化淤、祛風(fēng)利濕等功效，被廣泛用于婦科、風(fēng)濕痹痛等類型的中成藥生產(chǎn)［4］，如婦科千金片、金雞沖劑、金雞膠囊、補血調(diào)經(jīng)片、壯腰健腎丸、活絡(luò)止痛丸、復(fù)方海蛇酊、復(fù)方挫傷靈、腦萎縮丸等［5-7］，研究表明蔓性千斤含有蔓性千斤拔素 C、蔓性千斤拔素 D、5，7，3'，4'-四羥基-6，8-雙異戊烯基異黃酮、flemichin D、nC22-C30烷酸、β-谷甾醇、羽扇豆醇［8］、α-衣蘭烯，異長葉烯，8-石竹烯，卡達(dá)烯，金合歡醇異構(gòu)體［9］、iupinifolin、染料木苷(genistin)、槐屬苷、大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、島青霉素、咖啡酸二十八烷酯、單棕櫚酸甘油酯、濱蒿內(nèi)酯、水楊酸、對甲氧基苯丙酸、白樺酸［10］、染料木素(genistein)、dorsmanins、osajin、eriosematin、lupinalbinA、3'-O-甲基香豌豆苷［11］?，F(xiàn)代藥理研究表明:千斤拔具有鎮(zhèn)痛和抗炎作用［12］、對周圍神經(jīng)損傷的保護(hù)作用［13］、對腦組織及血腦屏障的保護(hù)作用［14］、抑制血栓形成［15］等作用。蔓性千斤拔為廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)中收載品種［14］，但對其藥材未作定量測定要求，為了更好地開發(fā)利用這一植物資源，我們參考其內(nèi)容，結(jié)合藥典規(guī)定對10個不同產(chǎn)地樣品從藥材性狀、顯微特征、浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分進(jìn)行了測定，采用了TLC及HPLC進(jìn)行了定性、定量研究，為制定蔓性千斤拔藥材的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)、開發(fā)新藥奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

儀器:210型高效色譜儀(美國VARIAN公司);KQ-5200型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);電子分析天平(CP2250D，Sartorius);LEICA生物顯微鏡(德國LaiLa);SX2-4JOA箱式電阻爐(上海比爾得儀器實業(yè)有限公司);101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營廠);W201型恒溫浴鍋(上海申生科技有限公司);高速萬能粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

試劑:甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher公司);水為超純水;甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯為分析純(分析純，成都市科龍化工試劑廠)。

藥材:蔓性千斤拔藥材采自廣西不同的產(chǎn)地，經(jīng)馬小軍研究員鑒定為豆科千斤拔屬植物蔓性千斤拔Flemingiae Philippinensis(Merr．et Rolfe)Li。

對照品:染料木素(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號:10020611);染料木苷(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號:09062911)。

2 方法與結(jié)果

2．1 鑒別

2．1．1 粉末顯微特征 粉末灰黃色。色素紅棕色，方形或不規(guī)則形，大小不一。淀粉粒眾多，單粒類圓形、橢圓形、多角形，臍點點狀、人字形、十字形等。復(fù)粒有2-5分粒組成。木栓細(xì)胞棕黃色，類方形或多角形。草酸鈣方晶少見。多具緣紋孔導(dǎo)管，紋孔密。纖維成束或單個。

2．1．2 薄層鑒別 取千斤拔藥材粉末2 g，置于100 mL具磨口塞錐形瓶中，加入80%的乙醇50 mL，超聲提取30 min，過濾，濾渣用80%的乙醇沖洗干凈，與濾紙一并放入100 mL具磨口塞錐形瓶中，加入80%的乙醇50 mL，超聲提取30 min，過濾，合并濾液，減壓蒸干，用甲醇轉(zhuǎn)溶至10 mL量瓶中并定容，搖勻，作為供試品液。另取染料木苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VB)試驗，吸取不同產(chǎn)地供試品溶液各10μL、對照品溶液5μL，分別點在同硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-冰乙酸(9∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈下(254 nm)檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。結(jié)果見圖1。另取染料木素苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VB)試驗，吸取不同產(chǎn)地供試品溶液各10μL、對照品溶液5μL，分別點在同硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-冰乙酸(6∶3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈下(254 nm)檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。結(jié)果見圖2。

圖1 千斤拔藥材中染料木苷的TLC圖

圖2 千斤拔藥材中染料木素的TLC圖

2．1．3 理化鑒別 蔓性千斤拔藥材水提液于蒸發(fā)皿中，加入婓林試劑，在水浴上加熱數(shù)分鐘，觀察，結(jié)果顏色由墨綠色變?yōu)榇u紅色(檢查多糖成分)。

2．2 浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分的測定

2．2．1 測定方法 浸出物測定參照藥典2010年版一部附錄XA浸出物測定法，采用冷浸法測定醇溶性浸出物，乙醇為95%;總灰分、酸不溶性灰分測定參照藥典2010年版一部附錄ⅨK灰分測定法;水分測定參照藥典2010年版一部附錄ⅨH水分測定法(烘干法)。

2．2．2 測定結(jié)果 10個不同產(chǎn)地的樣品的總灰分結(jié)果在3．17% ～6．08%之間，平均值為 4．55%，酸不溶性灰分結(jié)果在0．52% ～1．82%之間，平均值為0．98%。水浸出物結(jié)果在 8．59% ～16．11%，平均11．67%，醇浸出物結(jié)果 3．92% ～10．44%，平均6．74%，水分結(jié)果在 5．30% ～ 10．95%，平均9．11%，鑒于本品來自于野生資源，產(chǎn)地和采收情況比較復(fù)雜，灰分限量按照目前檢查樣品的平均值適當(dāng)上浮，暫定為總灰分不得過8%，酸不溶性灰分不得過2%，水浸出物不得少于7%，醇浸出物不得少于4%，水分不得大于10%。測定結(jié)果見表1。

表1 各產(chǎn)地千斤拔水分、灰分及浸出物測定結(jié)果Tab．1 Results ofmoisture，ash and extract in Flem ingiae philippinensis

2．3 染料木素和染料木苷的測定

2．3．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱:迪馬C18(4．6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相:A 相為甲醇-乙腈(8∶1)，B相為0．06%磷酸水，梯度洗脫(20%～60%A，0～30 min):檢測波長為 255 nm，柱溫為30℃，體積流量為1．0mL/min。在上述條件下樣品中染料木素和染料木苷與其他組分能夠達(dá)到基線分離，與相鄰的色譜峰分離度大于1．5，染料木素和染料木苷的理論塔板數(shù)不小于5 000，結(jié)果圖3。

圖3 蔓性千斤拔藥材供試品HPLC圖譜

2．3．2 供試品樣溶液的制備 同2．1．2項下供試品液的制備，最后以0．45μm的微孔濾膜過濾即得。

2．3．3 線性關(guān)系的考察 精密稱定染料木素對照品0．010 65 g、染料木苷苷 0．010 25 g，置 10 mL 量瓶中，用色譜甲醇溶解定容至刻度搖勻，得混標(biāo)對照品液A(其中染料木素質(zhì)量濃度為1．065 mg/mL、染料木苷質(zhì)量濃度為1．025 mg/mL)，從A中精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，用色譜甲醇稀釋定容至刻度，得混標(biāo)對照品液B(其中染料木素質(zhì)量濃度為0．021 3 mg/mL、染料木苷質(zhì)量濃度為 0．020 5 mg/mL)，B搖勻后以0．45μm的濾液微孔濾膜過濾，自動進(jìn)樣4、6、8、10、12、14 μL，以流動相按 2．1．2 項條件層析，體積流量:1．0 mL/min，以峰面積(Y)對進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:染料木素:Y=131．19X+4．92(r=0．999 1)、染料木苷:Y=88．64X+3．48(r=0．999 3)。結(jié)果表明:染料木素對照品進(jìn)樣量在0．085 2 μg～0．298 2 μg之間、染料木苷對照品進(jìn)樣量在0．082 0μg～0．287 0μg之間時，進(jìn)樣量與峰面積之間有良好的線性關(guān)系。樣品溶液按標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的色譜條件進(jìn)樣，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2．3．4 精密度考察 取染料木素和染料木苷混標(biāo)B進(jìn)樣4μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，染料木素和染料木苷的RSD值分別為0．54%、0．66%。

2．3．5 穩(wěn)定性考察 取千斤拔藥材粉末2 g，按2．1．1項制備供試品，于 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣 10 μL，按上述色譜條件測定峰面積，染料木素和染料木苷的RSD值分別為1．875%、1．246%，結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．3．6 重復(fù)性考察 取千斤拔藥材粉末2 g，精密稱定，共6份，按2．1．1項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，進(jìn)樣10μL，染料木素和染料木苷的RSD值分別為1．233%、1．729%。

2．3．7 回收率試驗 取已測定的千斤拔(含染料木素 0．106 7 mg/g、染料木苷 0．132 7 mg/g)藥材粉末6份，各1 g，精密稱定，精密加入1 mL染料木素對照品0．105 0 mg/mL、1 mL 染料木苷0．130 0 mg/mL，配制方法見2．1．1項，得供試品樣液，微孔濾膜濾過，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計算加樣回收率，結(jié)果:染料木素的平均回收率為 97．30%(RSD=1．80%，n=6)、染料木苷的平均回收率為 94．85%(RSD=1．85%，n=6)。結(jié)果如表 2、3。

表2 千斤拔藥材染料木素的加樣回收率結(jié)果

表3 千斤拔藥材染料木苷的加樣回收率結(jié)果

表4 千斤拔藥材中染料木素和染料木苷的含有量

2．3．8 樣品測試 取供試樣品，過0．45μm的微孔濾膜過濾，精密吸取10μL進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行測定，外標(biāo)法計算。結(jié)果表明:染料木素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．024 5～0．139 9 mg/g;染料木苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．058 9 ～0．228 9 mg/g，見表 4?？紤]本品來自于野生資源，產(chǎn)地和采收情況比較復(fù)雜，貯藏過程質(zhì)量的變化，擬定每克藥材染料木素不少于0．02 mg，染料木苷不少于0．05 mg/g。

3 討論

千斤拔藥材中有效成分檢測指標(biāo)的缺失嚴(yán)重影響其藥材質(zhì)量，建立千斤拔的定性定量的檢查方法對于保證千斤拔藥材的質(zhì)量具有重要意義。因此我們建立了千斤拔藥材中染料木素和染料木苷的薄層色譜檢識方法和高效液相色譜測定方法，并制定其限度，以期科學(xué)有效地控制藥材的質(zhì)量，保證其臨床療效。薄層色譜結(jié)果表明，10個不同產(chǎn)地千斤拔藥材樣品中，均檢出染料木苷，斑點清晰且方法簡便、快速、可行，故此方法可用作千斤拔藥材的定性鑒別。

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