鄭里翔， 林棟美， 劉紅寧， 余世平

(江西中醫(yī)學(xué)院，江西南昌330004)

乳腺癌是嚴(yán)重危害廣大婦女的健康最常見的惡性腫瘤之一。目前國內(nèi)外對(duì)乳腺癌的治療，仍以手術(shù)為主，化療、放療、激素和免疫等治療法，但這些療法常嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生存期。而中醫(yī)藥在防治乳腺癌方面的優(yōu)勢(shì)日益突顯，如可減毒增效、增加患者的生存期和生存質(zhì)量。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，乳腺癌發(fā)病機(jī)制是正虛邪實(shí)、虛實(shí)夾雜之癥，病變與肝腎脾及沖任有密切關(guān)系，其中正氣不足是乳腺癌發(fā)生的主要原因，肝郁脾虛、沖任失調(diào)是發(fā)生發(fā)展的重要因素，而邪氣入侵則是重要條件。中醫(yī)的臨床實(shí)踐已經(jīng)證明:乳腺癌患者，無論是在發(fā)病前、手術(shù)后以及放化療后均會(huì)出現(xiàn)陰虛，可見陰虛貫穿于乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過程，這為中醫(yī)藥防治乳腺癌提供了重要的思路。可見滋陰是防治乳腺癌重要的手段。六味地黃丸是滋陰名方，有大量的有關(guān)防治乳腺癌報(bào)道［1-5］。前期實(shí)驗(yàn)也已證實(shí):該方可抑制自發(fā)乳腺癌的生長(zhǎng)，但目前該方的作用機(jī)理尚不清楚。一系列的實(shí)驗(yàn)研究表明:TGF-β信號(hào)途徑在人類乳腺癌的發(fā)展過程中起到關(guān)鍵性的作用，它的表達(dá)水平的高低與乳腺癌的輕重有直接的關(guān)系［6-7］。故本研究將從TGF-β/ERK信號(hào)途徑入手，研究六味地黃丸的作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 試劑 六味地黃丸購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠(批號(hào):北京同仁堂，國藥準(zhǔn)字Z11021283，每粒0．2 g，每瓶裝360粒);Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，PCR引物由上海生工合成，兔抗 TGF-β、p-ERK1/2(ERK1p44，ERk2p42)單克隆抗體購于 SANT CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC，辣根過氧化物酶標(biāo)山羊抗兔IgG單克隆抗體購于北京中杉金橋公司，其他化學(xué)試劑都是國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1．2 儀器 ZT-12P生物組織自動(dòng)脫水機(jī) ，YB-6D生物組織石蠟包埋機(jī)，RM2235切片機(jī) LEICA，YT-6C生物組織攤烤片機(jī);OLYMPUS電子顯微鏡 (日出)，PCR擴(kuò)增儀(美國)、BIO-RAD垂直電泳儀 (美國)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha)，高速冷凍離心機(jī)(日本)，PCR儀(美國)，核酸蛋白質(zhì)分析儀(Eppendorf)。

1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)昆明小鼠360只，雌性種鼠，已產(chǎn)仔若干代，小鼠鼠齡約為11．5月，平均體質(zhì)量38～40 g，由江西中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)ZDW-NO．2007-170)。購買后，在封閉環(huán)境中、自然光線下進(jìn)行飼養(yǎng)，保持室內(nèi)溫度18～22℃，相對(duì)濕度50% ～60%，小鼠自由進(jìn)水。每3天觸診乳腺部位一次，發(fā)現(xiàn)腫塊［8］，隨機(jī)分成六味地黃丸［分高劑量組4．6g/(kg·d)、低劑量組 2．3g/(kg·d)］和對(duì)照組，六味地黃丸水蜜丸，于無菌室內(nèi)將120粒藥丸放入消毒研缽，加100 mL消毒蒸餾水研磨后，裝入消毒容器內(nèi)，配成終質(zhì)量濃度為0．24 g/mL，置于4℃冰箱備用。按成人劑量12 g/d換算成小鼠給藥劑量，患瘤小鼠給藥劑量為高劑量4．6 g/(kg·d)，低劑量為2．3 g/(kg·d)。六味地黃丸組灌胃給藥，直至患瘤小鼠瀕死期(癥狀:小鼠極度消瘦，精神萎靡，飲食明顯減少，表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍，心跳減弱，呼吸微弱，或出現(xiàn)周期性呼吸)，對(duì)照組(發(fā)瘤未給藥)、正常組(未發(fā)瘤小鼠)灌胃生理鹽水(對(duì)照組給生理鹽水平均時(shí)間為59d;低劑量組給藥時(shí)間為83d;高劑量給藥時(shí)間為80．7d)，處死，記錄發(fā)瘤至瀕死期時(shí)間，剝離瘤塊，稱質(zhì)量。留取部分行病理組織切片確診(光鏡下可見癌細(xì)胞排列呈片狀、巢狀，少部分癌細(xì)胞排列呈腺管樣，癌細(xì)胞核漿比例增大，胞核可見核分裂像)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 乳腺癌組織病理分析 取新鮮的癌組織用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定，分別用85% 、95%酒精、無水酒精逐漸脫水，再用二甲苯透明，石蠟包埋，切片與貼片，HE染色，X400觀察并拍照。

2．2 半定量的RT-PCR 按照TRIZOL試劑說明書提取總RNA，在20μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增。TGF-β、p-ERK上下游引物為:p-ERK1/2:F:5 ＇-TGCACCGTGACCTCAAGCCTT-3 ＇，R:5 ＇-GGCCAGAGCCTGTTCAACTTCAAT-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度491bp;TGF-β1 F:5 ＇-GCAATGGGCTTAGTGTTCTGGGT-3 ＇，R:5 ＇-TGCCTTCCTGTTGGCTGAGTT-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 295bp;β-actin F:5 ＇-CGTGCGTGACATTAAAGAC-3 ＇，R:5 ＇-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 476bp。

25μLPCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)(擴(kuò)增條件為:p-ERK mRNA:95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸5 min;TGF-β1 mRNA:95℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min)。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠溴化乙錠電泳分離，用凝膠圖形分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照，觀察結(jié)果并測(cè)定灰度值，以擴(kuò)增的目的條帶和同時(shí)擴(kuò)增的β-actin的灰度值比對(duì)各基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行衡量。

2．3 蛋白印跡 用SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)印100 mA 40 min，4℃冰箱封閉過夜，與特異性抗體結(jié)合:將一抗用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度(兔抗TGF-β1稀釋比例為1∶400，小鼠抗p-ERK稀釋比例為1∶400);室溫下孵育1～2 h后或4℃冰箱孵育過夜，隨后用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min;再用TBS洗一次，10 min。將二抗用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度(辣根過氧化物酶標(biāo)山羊抗兔IgG稀釋比例為1∶25 000，辣根過氧化物酶標(biāo)山羊抗小鼠IgG稀釋比例為1∶25 000)，取3 mL稀釋液與膜接觸，室溫下孵育1～2 h后或4℃冰箱孵育過夜，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min;再用TBS洗一次，10 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行上述蛋白的半定量分析。

2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15．0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行LSD檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(± s)表示。

3 結(jié)果

3．1 病理分析確診乳腺癌 經(jīng)HE染色后，正常小鼠乳腺細(xì)胞形態(tài)完整，腺管豐富(圖1A);對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量較多，呈松散、紊亂樣排列，以散在和(或)小細(xì)胞群為主，腺管消失，細(xì)胞核大深染，核多形，層次增多，細(xì)胞異型性大，細(xì)胞排列雜亂無極性核，大小差異明顯(見圖1B)，為典型的乳腺癌。

圖1 不同組乳腺病理形態(tài)(10×40)

3．2 六味地黃丸對(duì)腫瘤瘤質(zhì)量的影響 經(jīng)六味地黃丸治療后，瘤質(zhì)量明顯下降(P＜0．01)，說明六味地黃丸能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)(見圖2)。

3．3 六味地黃丸對(duì)瘤體內(nèi)TGF-β、p-ERK基因表達(dá)產(chǎn)物的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:六味地黃丸能明顯抑制瘤體中的TGF-β、p-ERK 基因的表達(dá)(P ＜0．01或 P ＜0．05)。見表2。

圖2 六味地黃丸對(duì)荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的影響與對(duì)照組比較*P＜0．05

表2 六味地黃丸對(duì)瘤體內(nèi)TGF-β、p-ERK基因表達(dá)的影響 ( ± s)

表2 六味地黃丸對(duì)瘤體內(nèi)TGF-β、p-ERK基因表達(dá)的影響 ( ± s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0．01。

組別 劑量/(g/kg) mRNA 的表達(dá)量TGF-βp-ERK蛋白表達(dá)量TGF-βp-ERK正常組 0．66 ±0．14(15) 0．50 ±0．13(15) 0．47 ±0．08(14) 1．23 ±0．12(16)對(duì)照組 － 1．32 ±0．15(16) 1．14 ±0．14(16) 1．16 ±0．10(16) 3．83 ±0．16(16)六味地黃高劑量組 2．3 0．90 ±0．13*(15) 0．79 ±0．16*(15) 0．74 ±0．06*(15) 2．72 ±0．19*(15)六味地黃低劑量組 4．6 0．77 ±0．09*(16) 0．59 ±0．11*(16) 0．56 ±0．07*(16) 1．37 ±0．11*(16)

4 討論

目前中醫(yī)藥治療乳腺癌的方法主要有大補(bǔ)氣血、健脾和胃、滋陰補(bǔ)腎、活血養(yǎng)血、清熱解毒。黎壯偉等［10］根據(jù)晚期乳腺癌的病理特點(diǎn)及疾病發(fā)展的不同時(shí)期，將乳腺癌分為5型，對(duì)于其中肝腎虧虛型者，擬滋補(bǔ)肝腎、調(diào)和沖任，方用六味地黃丸加味;周斌等［11］認(rèn)為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的病因主要是腎虛，加之氣血兩虛，使其易被癌瘤所侵襲而發(fā)病，因此防治乳腺癌常采用以溫補(bǔ)腎陽、滋補(bǔ)腎陰、平衡陰陽、調(diào)理氣血法為主，臨床實(shí)踐已證實(shí):六味地黃丸能改善乳腺癌患者的臨床癥狀，提高患者的生存質(zhì)量和延長(zhǎng)患者的生存期［3-4］。

圖2的結(jié)果表明:六味地黃丸能明顯抑制乳腺癌的生長(zhǎng)(P＜0．05)，這是因?yàn)榉街械氖斓攸S、山藥、山茱萸均能提高機(jī)體免疫機(jī)能、誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生、抗氧化、抑制腫瘤生長(zhǎng);牡丹皮有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞作用;茯苓具有抗炎的功能［5］，諸藥合用達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)目的。

同時(shí)六味地黃丸能明顯抑制腫瘤組織內(nèi)的TGF-β/p-ERK的基因表達(dá)(P＜0．01或P＜0．05)。研究表明:從果蠅到人類均有TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，TGF-β激活受體，進(jìn)一步激活ERK。ERK屬于酪氨酸蛋白激酶，是MAPK家族主要的和經(jīng)典的成員，主要傳遞細(xì)胞絲裂原信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。p-ERK是其活化形式。激活的ERK可促進(jìn)細(xì)胞漿靶蛋白磷酸化或調(diào)節(jié)其它蛋白激酶的活性。更重要的是激活的ERK進(jìn)入核內(nèi)，促進(jìn)多種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，它們所參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路的過度活化與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)［6-7］。故六味地黃丸抑制TGF-β/p-ERK基因的表達(dá)，從而抑制了乳腺癌進(jìn)一步的發(fā)展。

由于動(dòng)物自發(fā)性腫瘤從其發(fā)生發(fā)展來看與人類腫瘤更相似，因而更適用于研究人類腫瘤。該模型最大的特點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未經(jīng)任何有意識(shí)的人工處理，生存到一定年齡便自然發(fā)生乳腺腫瘤，排除了很多人為的干擾因素，使得影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的因素更有可能被發(fā)現(xiàn)，因而更具有研究?jī)r(jià)值和前景［9］。

［1］張 勇．乳腺癌的中醫(yī)治療［J］．光明中醫(yī)，2009，24(1):178-179．

［2］馮玉龍．乳腺癌的中醫(yī)藥治療集萃［J］．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10(5):180-181．

［3］張榮華，李配富．中醫(yī)藥治療乳腺癌研究概況［J］．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17(16):2580-2581．

［4］蔡焦生，楊樹明，張愛萍．六味地黃丸的臨床應(yīng)用機(jī)制［J］．中國社區(qū)醫(yī)生，2008，10(7):5-6．

［5］何立麗．孫桂芝治療乳腺癌經(jīng)驗(yàn)［J］．北京中醫(yī)藥，2009，28(1):18-19．

［6］Ganapathy V，Ge R，Grazioli A，etal．Targeting the transforming growth factor-beta pathway inhibits human basal-like breast cancer metastasis［J］．Mol Cancer，2010 ，26(9):122-128．

［7］Stuelten C H，Busch J I，Tang B，et al．Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in amouse xenograftmodel of breast cancer［J］．PLoSOne，2010 ，5(3):e9832．

［8］施新猷主編．醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，1980．

［9］楊桂仙，張大方．乳腺癌動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀與評(píng)價(jià)［J］．長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(2):82-83．

［10］黎壯偉，陳銳深．中醫(yī)藥治療晚期乳腺癌臨證體會(huì)［J］．湖南中醫(yī)雜志，2005，21(5):47-48．

［11］周 斌，曾柏榮．六味地黃丸在腫瘤治療中的作用［J］．腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2010，23(1):91-93．