王秋萍， 王桐生， 龍子江， 劉向國(guó)， 饒玉松， 孫 鑫， 陳 花

(1．安徽省疾病預(yù)防控制中心毒理室，安徽合肥230031;2．安徽中醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽合肥230038;3．安徽中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽合肥230038)

少精子癥、弱精子癥是男性不育最常見的病因之一。引起男性少、弱精癥的病因病機(jī)復(fù)雜，其治療方法還處在探索發(fā)展階段，中醫(yī)藥在“補(bǔ)腎”為其治療大法的基礎(chǔ)上進(jìn)行辨證論治，對(duì)改善精子的數(shù)量和質(zhì)量及運(yùn)動(dòng)功能方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)典補(bǔ)腎方劑五子衍宗丸為研究對(duì)象，系統(tǒng)觀察該方劑對(duì)少弱精模型大鼠精子質(zhì)量及睪丸組織病理改變的影響，以期探討“補(bǔ)腎法”的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性 Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g，SPF級(jí)，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為:SCXK(皖)2005-001號(hào)。

1．2 實(shí)驗(yàn)藥物 五子衍宗丸(枸杞子、覆盆子、菟絲子、五味子、車前子)，劑量參考《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版中五子衍宗丸成分中各藥比例計(jì)算，每劑含枸杞子16 g、菟絲子16 g、覆盆子8 g、車前子4 g、五味子2 g，采用水煎濃縮成合適濃度備用。雷公藤多苷片，10 mg/片，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):100502;黃精贊育膠囊，上海新亞藥業(yè)邢江有限公司生產(chǎn)，0．31 g/粒，批號(hào):100502。

1．3 實(shí)驗(yàn)儀器 OLYMPUSBX60光學(xué)顯微鏡;恒溫水浴鍋箱，北京東霞科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。病理組織包埋機(jī)、組織切片機(jī)等。

2 方法

2．1 動(dòng)物分組及給藥［1］取體質(zhì)量為180～200 g的雄性大鼠60只，隨機(jī)分成正常組，模型組，黃精贊育膠囊組(陽(yáng)性組，3．01 g/kg)，五子衍宗丸小、中、大劑量組(分別為 3．83、7．67、15．33 g生藥/kg，按公斤體質(zhì)量計(jì)算相當(dāng)于人用量 46 g生藥/d的5、10、20倍)。除正常組外，其他各組動(dòng)物灌胃給予雷公藤多苷30 mg/(kg·d)(用0．5%CMCNa制成混懸液)，連續(xù)30 d，造成少弱精子癥模型。造模結(jié)束后各組動(dòng)物按劑量灌胃給藥，1 mL/100 g體質(zhì)量，連續(xù)給藥30 d，末次給藥后30 min，處死動(dòng)物，摘取睪丸、附睪，做相關(guān)檢測(cè)。

2．2 精子計(jì)數(shù)、活率測(cè)定［2］將盛有6 m L生理鹽水的試管置于恒溫水浴箱內(nèi)預(yù)熱至37℃，然后將一側(cè)附睪剪碎放入試管中，搖勻，37℃保溫15 min，使精子充分游離。取1滴適當(dāng)稀釋后滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)中方格內(nèi)精子數(shù)(n)，每毫升精子數(shù)為n×5×稀釋倍數(shù)×104。另取1滴涂片，觀察精子活率，至少觀察200個(gè)精子，分別計(jì)數(shù)有活動(dòng)力及無(wú)活動(dòng)力的精子數(shù)。精子活率=活動(dòng)精子數(shù)/(活動(dòng)精子數(shù)+不動(dòng)精子數(shù))×100%。

2．3 睪丸組織病理學(xué)檢查 取新鮮的睪丸組織，采用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色，光鏡下進(jìn)行病理學(xué)檢查。

3 結(jié)果

3．1 五子衍宗丸對(duì)少弱精癥模型大鼠精子質(zhì)量影響 結(jié)果見表1。

表1 五子衍宗丸對(duì)少弱精癥模型大鼠精子質(zhì)量影響( ± s，n=10)

表1 五子衍宗丸對(duì)少弱精癥模型大鼠精子質(zhì)量影響( ± s，n=10)

與正常組比，*P ＜0．05;與模型組比，ΔP ＜0．05。

組別 劑量/(g/kg)精子活力/%精子密度/(×106/mL)正常組 － 78．90±9．15Δ 26．40±3．63Δ模型組 － 33．50±13．39* 13．90±3．41*贊育膠囊組 3．01 58．10 ±13．96*Δ 18．90 ±8．91*五子衍宗丸組(小) 3．83 42．19 ±9．59* 17．40 ±6．19*五子衍宗丸組(中) 7．67 51．20 ±12．02*Δ 17．20 ±4．47*五子衍宗丸組(大) 15．34 58．90 ±16．73*Δ 22．20 ±8．50Δ

由表1可見:雷公藤多苷連續(xù)造模30 d后，模型大鼠的精子活力與精子密度明顯下降，與正常組比差異有顯著性意義(P＜0．05)。連續(xù)給藥30 d后，五子衍宗丸各劑量組動(dòng)物的精子活力和精子密度均明顯增加，其中五子衍宗丸中、高劑量組的精子活力、高劑量組的精子密度與相應(yīng)模型組比差異顯著(P ＜0．05)。

3．2 五子衍宗丸對(duì)少弱精癥模型大鼠睪丸組織的影響 結(jié)果見圖1。

圖1 五子衍宗丸對(duì)少弱精癥模型大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響

光鏡檢查可見:正常組大鼠睪丸生精小管呈圓形或卵圓形，生精小管內(nèi)含大量精子。精原細(xì)胞圓而規(guī)則，緊貼在生精小管的基底膜。各期生精細(xì)胞排列整齊、緊密、有序，層次分明。支持細(xì)胞形態(tài)正常。模型組大鼠睪丸生精小管生精上皮明顯變薄，生精細(xì)胞脫落，細(xì)胞層次紊亂，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞減少，精子細(xì)胞及精子減少更加明顯，睪丸間質(zhì)細(xì)胞輕度水腫。其他給藥各組大鼠睪丸生精小管呈圓形或卵圓形，生精小管內(nèi)含大量精子。生精細(xì)胞排列稍疏松，結(jié)構(gòu)清楚，層次分明，細(xì)胞層次減少，精原細(xì)胞數(shù)量正常，形態(tài)圓而規(guī)則，緊貼在生精小管的基底膜，其他各期生精細(xì)胞數(shù)量略減少，部分區(qū)域見少量生精細(xì)胞脫落。

4 討論

有資料表明，雷公藤制劑對(duì)生殖系統(tǒng)的損傷部位在睪丸和附睪，以精子細(xì)胞和精子最為敏感，雷公藤多苷大劑量時(shí)精子細(xì)胞和精母細(xì)胞變性壞死，使睪丸組織造精功能喪失，失去生育能力［3-4］。本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷連續(xù)給藥30 d后，雄性大鼠睪丸生精小管生精上皮明顯變薄，生精細(xì)胞脫落，細(xì)胞層次紊亂，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞減少，精子細(xì)胞及精子減少明顯，睪丸間質(zhì)細(xì)胞輕度水腫，說(shuō)明模型制備成功，采用雷公藤多苷制備少弱精子癥方法可靠。

少弱精子癥屬于中醫(yī)“精冷”、“精清”、“精少”范疇，“腎藏精，主生殖”，腎臟的精氣盛衰直接影響人類的生殖健康，因此大多數(shù)醫(yī)家對(duì)男性不育癥多以“腎虛”立論，治療多從補(bǔ)腎著手［5-6］。五子衍宗丸為著名的補(bǔ)益方劑，全方由枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子五種中藥組成，方中枸杞子滋腎填精、菟絲子溫腎益精，共為君藥;覆盆子溫腎而不燥、固精而不凝，五味子益氣補(bǔ)虛、強(qiáng)陰澀精，共為臣藥;車前子清肝肺風(fēng)熱，導(dǎo)膀胱水邪，利水而不動(dòng)氣，用為佐藥。全方不涼不燥，共奏補(bǔ)腎填精、疏利腎氣、種嗣衍宗之功，被譽(yù)為古今“種子第一方”［7-8］。本研究發(fā)現(xiàn)，五子衍宗丸能明顯提高模型動(dòng)物精子活力，改善精子密度，并對(duì)睪丸組織的損傷有一定的保護(hù)作用，說(shuō)明“補(bǔ)腎”法對(duì)少弱精子癥的治療有明顯療效，但其治療機(jī)制及科學(xué)內(nèi)涵有待進(jìn)一步研究。

［1］李德忠，李曉明，周小煦，等．補(bǔ)腎毓麟湯對(duì)雷公藤多苷致傷大鼠睪丸生殖細(xì)胞的修復(fù)作用［J］．中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006，12(7):522-525．

［2］邵祥龍，羅 瓊，秦 芹，等．山茱萸多糖對(duì)雄性大鼠性功能損傷的影響［J］．中國(guó)中藥雜志，2010，35(6):772-775．

［3］姚青海，王知俠，劉潤(rùn)霞，等．育生液治療大鼠少精癥、弱精癥的實(shí)驗(yàn)研究［J］．西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2004，25(2):165-167．

［4］俞晶華，卞慧敏，張啟春，等．補(bǔ)天育麟顆粒對(duì)雷公藤多苷致大鼠不育癥模型的影響［J］．南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(5):313-315．

［5］劉 鐵，蘇家文．清熱利濕結(jié)合補(bǔ)益生精法治療不育癥的臨床觀察［J］．中國(guó)性科學(xué)，2010，19(9):18-20．

［6］徐 璐，熊國(guó)保，胥杜鵑，等．少弱精癥的中西醫(yī)治療現(xiàn)狀與進(jìn)展［J］．現(xiàn)代診斷與治療，2009，20(2):82-85．

［7］王志強(qiáng)，梁 兵，黃耀全．五子衍宗丸治療男性不育少弱精子癥的療效觀察［J］．廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27(2)291-292．

［8］張長(zhǎng)城，賈亮亮，許 佳，等．五子衍宗湯對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠生精障礙保護(hù)作用的研究［J］．中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，16(7):570-572．