虞 龍，張 宇，龔文靜，安 肖，徐 翔

（1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

紅霉素是1952年問(wèn)世的第1個(gè)由放線菌產(chǎn)生的14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，抗菌譜與青霉素相似，主要是對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如金葡菌、溶血性鏈球菌、肺炎球菌、白喉?xiàng)U菌、炭疽桿菌及梭形芽胞桿菌等有強(qiáng)大的抗菌作用［1］。雖然現(xiàn)今抗菌藥物越來(lái)越多，紅霉素在治療領(lǐng)域仍占有自己的地位。尤其是半合成紅霉素衍生物的開發(fā)成功如阿齊霉素、甲紅霉素、地紅霉素、羅紅霉素、氟紅霉素等，使得大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在未來(lái)的抗感染藥物中所擁有的市場(chǎng)份額進(jìn)一步提升和擴(kuò)大。

在幾種可行易操作的誘變方法中，紫外誘變可使DNA分子形成嘧啶二聚體，即兩個(gè)相鄰的嘧啶共價(jià)連接；氯化鋰誘變可導(dǎo)致AT－GC堿基對(duì)的轉(zhuǎn)換或?qū)е聣A基的缺失；離子束誘變是利用正電荷低能離子束注入生物體引起遺傳物質(zhì)的可遺傳性改變。離子束對(duì)生物體有能量沉積、動(dòng)量傳遞、粒子注入和電荷交換等4個(gè)原初反應(yīng)過(guò)程［2］，生物體從而產(chǎn)生DNA分子斷裂、堿基缺失等物理?yè)p傷、自由基化學(xué)損傷等多種生物學(xué)效應(yīng)［3］。復(fù)合誘變包括兩種或多種誘變劑的先后使用、同一種誘變劑的重復(fù)作用和兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用。普遍認(rèn)為［4］，復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)，兩種或兩種以上誘變劑合理搭配進(jìn)行復(fù)合誘變較單一誘變效果好。

本文將紫外－氯化鋰－離子束結(jié)合起來(lái)對(duì)紅霉素生產(chǎn)菌——紅色鏈霉菌進(jìn)行復(fù)合誘變。

1 材料與方法

1.1 菌種

紅色鏈霉菌，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面／平板培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，玉米漿1.0%，淀 粉 1.0%，硫 酸 銨 0.3%，氯 化 鈉0.3%，碳酸鈣0.25%，瓊脂1.5%，pH＝6.5。

氯化鋰平板培養(yǎng)基：平板培養(yǎng)基加上一定濃度的氯化鋰。

種子培養(yǎng)基：淀粉3.5%，硫酸銨0.75%，氯化鈉0.5%，蛋白胨0.5%，糊精2.0%，葡萄糖3.0%，酵母粉2.0%，碳酸鈣0.8%，硫酸鎂0.05%，磷 酸 氫 二 鉀 0.08%，豆 油 0.2mL／25mL，pH＝6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉3.0%，硫酸銨0.5%，葡萄糖2.0%，玉米漿0.1%，碳酸鈣0.9%，豆油0.3mL／25mL，pH＝6.5。

1.3 培養(yǎng)條件

斜面／平板培養(yǎng)：用無(wú)菌操作將孢子懸浮液接于斜面／平板培養(yǎng)基上，置37℃恒溫室中培養(yǎng)6～7d。

種子培養(yǎng)：在250mL三角瓶?jī)?nèi)裝50mL種子培養(yǎng)基，接種量為10%，于33℃下培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速為220r／min。

發(fā)酵培養(yǎng)：搖瓶為500mL三角瓶，裝液量50%，接種量10%，于33℃下培養(yǎng)7d，搖床轉(zhuǎn)速為220r／min。

1.4 誘變及篩選方法

1.4.1 單孢子懸浮液制備 成熟的新鮮斜面加無(wú)菌水10mL，刮洗下培養(yǎng)好的新鮮斜面孢子后傾于帶有一定玻璃珠的250mL三角瓶?jī)?nèi)振搖 20min（250r／min），取出過(guò)濾成菌懸液［5］，備用。

1.4.2 氯化鋰處理 取0.2mL菌懸液均勻涂布于不同濃度（0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%）的氯化鋰平板培養(yǎng)基上，同條件下無(wú)氯化鋰的平板培養(yǎng)基為對(duì)照樣。

1.4.3 紫外誘變處理 取0.2mL菌懸液均勻涂布于生長(zhǎng)平板培養(yǎng)基上，先開啟20W紫外燈，預(yù)熱20min，再將培養(yǎng)皿放在紫外燈下30cm 處，打開平皿蓋，照射30、60、90、120、150、180s，同條件下不進(jìn)行照射的為對(duì)照樣。

1.4.4 離子束誘變處理 取0.1mL菌懸液均勻涂布于無(wú)菌平皿上，以無(wú)菌風(fēng)吹干。鏡檢無(wú)細(xì)胞重疊者進(jìn)行離子注入。注入能量為10keV，注量（×1014）為50、100、150、200、250、300cm－2，靶室真空度為10－3Pa。將平皿置于靶臺(tái)上，以10s脈沖式注入，間隔50s，以降低溫度效應(yīng)的影響，靶室內(nèi)放置不接受照射的對(duì)照樣。離子注入后，取出平皿，以1mL無(wú)菌水洗脫，涂平板培養(yǎng)基。

1.4.5 氯化鋰－紫外－離子束復(fù)合誘變 將菌懸液先涂布于含有一定濃度氯化鋰的平板培養(yǎng)基上，經(jīng)紫外燈照射一定時(shí)間后進(jìn)行培養(yǎng)，待其成熟制作成菌懸液進(jìn)行離子注入，注入后再將其涂布于氯化鋰平板培養(yǎng)基上；以相同的操作，取未經(jīng)氯化鋰、紫外線、離子束處理的菌懸液稀釋涂布平板為對(duì)照樣。

1.4.6 篩選方法 從培養(yǎng)成熟的平板菌落中挑選正常型菌落接斜面，待生長(zhǎng)成熟后按10%接種量接入搖瓶進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.7 存活率和正突變率計(jì)算 菌株的存活率為其誘變后在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)與同條件下未經(jīng)誘變的對(duì)照菌株在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)的比值。正突變率為效價(jià)與對(duì)照菌株相比提高在5%以上的菌株占全部被考察菌株的比例。

1.5 分析方法

1.5.1 pH測(cè)定 取搖瓶發(fā)酵液過(guò)濾后用上海雷磁pHS－3B型精密pH計(jì)測(cè)量。

1.5.2 殘?zhí)菧y(cè)定 發(fā)酵液過(guò)濾后稀釋一定倍數(shù)，采用SBA40型生物傳感器進(jìn)行測(cè)定。

1.5.3 產(chǎn)物液相測(cè)定 色譜柱，不銹鋼柱（內(nèi)裝填 料 PLRS－S，10nm，長(zhǎng) 250mm，內(nèi) 徑4.6mm，Agilent）；流動(dòng)相，乙腈與0.04mol／L NH4H2PO4體積比為1∶2混合液，pH＝7.0；檢測(cè)波長(zhǎng)，210nm；柱溫，室溫；流速，1.0mL／min；進(jìn)樣量，100μL［6］。

2 結(jié)果與討論

2.1 氯化鋰劑量確定

在經(jīng)氯化鋰處理后的每個(gè)劑量的平板中各挑出20個(gè)菌株進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，考察氯化鋰濃度對(duì)紅色鏈霉菌存活率和正突變率的影響，結(jié)果如圖1所示。在存活率逐漸下降的情況下，突變率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)氯化鋰濃度為1.2%時(shí)，紅色鏈霉菌的存活率為90.15%，同時(shí)正突變率最高，為16.22%。因此，本實(shí)驗(yàn)確定1.2%為最佳氯化鋰誘變劑量。

圖1 不同氯化鋰濃度下菌種的存活率和正突變率Fig.1 Survival rate and mutation rate with different concentrations of LiCl

2.2 紫外劑量確定

在經(jīng)紫外照射處理后的每個(gè)劑量的平板中各挑出20個(gè)菌株進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，考察紫外輻照時(shí)間對(duì)紅色鏈霉菌存活率和正突變率的影響，結(jié)果如圖2所示。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［4］，采用紫外線誘變，一般致死率為70%～80%時(shí)，產(chǎn)生正突變的幾率較高，有利于突變株的進(jìn)一步篩選。由圖2可見，紫外具有較強(qiáng)的殺菌能力，輻照120s時(shí)，正突變率最高，達(dá)20.05%，同時(shí)存活率僅21.83%，輻照180s時(shí)幾乎無(wú)菌存活。因此，本實(shí)驗(yàn)確定120s為最佳紫外誘變時(shí)間。

圖2 不同紫外照射時(shí)間下菌種的存活率和正突變率Fig.2 Survival rate and mutation rate with different time of UV

2.3 離子束注量確定

在經(jīng)離子束誘變后的每個(gè)注量的平板中各挑出20個(gè)菌株進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，考察離子束注量對(duì)紅色鏈霉菌存活率和正突變率的影響，結(jié)果如圖3所示。對(duì)于10keV氮離子，離子注量小時(shí)菌株的存活率較高，注量增大存活率呈下降趨勢(shì)，但在200×1014cm－2附近，存活率有短暫回升，整個(gè)存活率曲線呈“馬鞍形”，同時(shí)正突變率也達(dá)28.73%。對(duì)于“馬鞍型”曲線形成的原因，宋道軍等［7］認(rèn)為當(dāng)注量較小時(shí)，存活率下降是能量沉積效應(yīng)和動(dòng)量傳遞效應(yīng)綜合作用的結(jié)果。因小注量下低能N＋的直接作用可導(dǎo)致DNA的損傷，能量沉積所產(chǎn)生的大量自由基亦會(huì)導(dǎo)致DNA和生物膜等其他生物大分子的損傷，從而造成存活率下降。繼續(xù)提高注量，大量連續(xù)注入電荷的堆積會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的庫(kù)侖斥力，這種庫(kù)侖斥力能對(duì)被注入細(xì)胞形成一“保護(hù)屏障”，阻礙后續(xù)注入離子對(duì)細(xì)胞的損傷，從而達(dá)到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用；且大量堆積的電荷可形成一弱電場(chǎng)，這種電場(chǎng)的刺激效應(yīng)可激活菌體內(nèi)的各種酶，尤其是修復(fù)酶，從而提高了損傷修復(fù)的效率，存活率又有所回升。當(dāng)注量繼續(xù)增大時(shí)，能量沉積和動(dòng)量傳遞所造成的DNA和生物膜等其他生物大分子的嚴(yán)重?fù)p傷已超出其所具有的修復(fù)能力，聚集于細(xì)胞表面的電荷產(chǎn)生庫(kù)侖爆炸，使細(xì)胞失去電荷屏蔽而使存活率急劇下降。另外，在200×1014cm－2下，菌株的正突變率最高，與其對(duì)應(yīng)的存活率一致，因此，本試驗(yàn)確定200×1014cm－2為最佳離子束誘變注量。

圖3 不同氮離子注量下菌種的存活率和正突變率Fig.3 Survival rate and mutation rate with different ion fluences

2.4 復(fù)合誘變對(duì)菌體的影響

按上述確定的誘變條件進(jìn)行氯化鋰－紫外－離子束復(fù)合誘變。取在最優(yōu)條件下分別經(jīng)氯化鋰、紫外、離子束與復(fù)合誘變的正突變菌株各50株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果列于表1。由表1可見，復(fù)合誘變的存活率最低，但正突變率高達(dá)43.50%，效價(jià)提高幅度大的菌株所占比例最高。在3種單一誘變方式中，氯化鋰誘變的存活率最高，但效價(jià)提高10%以上的菌株比例不高；紫外誘變的存活率最低，菌株提高幅度也不大；經(jīng)離子束誘變的菌株存活率雖不高，但正突變率最高，且菌株產(chǎn)量提高幅度高于其他兩種誘變方式。可見，如果要使用單一誘變方式，可選擇用離子束進(jìn)行誘變。由多次復(fù)合誘變篩選到1株高產(chǎn)菌株，命名為E0317－1－7－26。

2.5 高產(chǎn)菌株分離穩(wěn)定性考察

將高產(chǎn)菌株 E0317－1－7－26作為出發(fā)菌株，分離3代，進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定，考察其分離穩(wěn)定性，結(jié)果示于圖4。由圖4可見，每代的產(chǎn)量提高幅度均呈下降趨勢(shì)，但第3代產(chǎn)生回復(fù)性趨勢(shì)。結(jié)果表明，經(jīng)3代分離后，菌體不但穩(wěn)定性增強(qiáng)，而且產(chǎn)量也有穩(wěn)定性提高。

表1 誘變結(jié)果Table 1 Result of mutation

圖4 菌體的效價(jià)提高范圍Fig.4 Increasing range of high－producing strain titer

2.6 高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性考察

將出發(fā)菌株和高產(chǎn)菌株 E0317－1－7－26各傳代5次，每代3個(gè)平行樣，發(fā)酵完進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定，取3個(gè)樣的平均值，考察高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果列于表2，其中F1～F5分別表示第1至第5代。由表2可知，高產(chǎn)菌株E0317－1－7－26經(jīng)傳代5次后，效價(jià)略有下降，F(xiàn)2雖下降幅度較大，但F3效價(jià)回復(fù)性提高，然后逐漸穩(wěn)定。平均效價(jià)達(dá)7 093μg／mL。

表2 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 2 Inheritance stability of high－producing strain

3 結(jié)論

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同誘變方式對(duì)紅色鏈霉菌產(chǎn)生了不同的生物效應(yīng)，單獨(dú)使用一種誘變方式可獲得突變菌株，但幾率很低。某一菌株長(zhǎng)期使用誘變劑后，會(huì)對(duì)誘變劑產(chǎn)生“鈍化效應(yīng)”。因此，目前在實(shí)驗(yàn)中多采用幾種誘變劑復(fù)合處理、交叉使用的方法進(jìn)行菌種選育。相關(guān)資料［8］也表明，復(fù)合誘變較單誘變劑處理后的效果好，通常是物理誘變復(fù)合化學(xué)誘變。在誘變育種中，誘變劑的選擇較為重要，選擇較合適的誘變劑會(huì)大幅減少工作量。

由表1可看出，復(fù)合誘變能在很大程度上獲得高產(chǎn)菌株，紫外和離子束誘變過(guò)的菌株經(jīng)氯化鋰作用，其提高的抗生素效價(jià)能夠保持穩(wěn)定，這可能與氯化鋰能夠抑制菌體的自我修復(fù)有關(guān)。經(jīng)紫外和離子束誘變過(guò)的存活孢子經(jīng)氯化鋰作用，有“提高突變‘易出誤差’修復(fù)”的作用［9］，即氯化鋰可穩(wěn)定紫外和離子束所引起的遺傳物質(zhì)的改變。但不是所有的誘變劑都對(duì)所選的菌株產(chǎn)生相同的誘變效應(yīng)，菌株本身對(duì)不同的誘變劑的抵抗能力不同。在這3種誘變方式中，對(duì)紅色鏈霉菌而言，離子束作為單因素誘變效果最好（圖3）?？傊?，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了在紅色鏈霉菌育種中，復(fù)合誘變優(yōu)于單因素誘變，篩選到目的菌株的概率相對(duì)較大。

本文研究了利用氯化鋰、紫外和離子束復(fù)合誘變選育紅霉素生產(chǎn)菌——紅色鏈霉菌，比較了3種誘變方式的不同誘變結(jié)果，由此確定氯化鋰的最優(yōu)誘變濃度為1.2%，紫外的最優(yōu)誘變時(shí)間為120s，離子束的最優(yōu)誘變注量為200×1014cm－2。再將3種最優(yōu)誘變條件組合，用復(fù)合誘變方法篩選到1株高產(chǎn)菌株E0317－1－7－26。與出發(fā)菌株相比，高產(chǎn)突變菌株發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的能力從5 923μg／mL提高到7 126μg／mL，且遺傳性能穩(wěn)定，為實(shí)現(xiàn)紅霉素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了保證。另外，該方法可快速有效地獲得較理想的抗生素高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)優(yōu)良菌株，拓寬了它在制藥生物工程中的應(yīng)用前景，為今后微生物誘變選育打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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