張海燕,楊俊海,劉 琪

(1.北京電力醫(yī)院口腔科,北京,100073;2.北京電力醫(yī)院健康管理中心,北京100073;3.貴州遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院,貴州遵義,563003)

期望獲得因疾病破壞的牙周支持組織的重塑及再生是當(dāng)今牙周病治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1]。在牙周組織的重塑和再生過程中,牙根面的生物相容性是一個(gè)重要因素,為促進(jìn)牙周附著,根面進(jìn)行平整后,通常采用根面處理,不僅可清除殘存于根面的內(nèi)毒素等有害物質(zhì),提高根面的生物相容性,而且有利于促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞(PDLF)、牙齦成纖維細(xì)胞(HGF)等對牙根面的附著和增殖[2-3]。

貧血小板血漿(PPP)即纖維素(Fibrin),它是由人自身的新鮮全血制成,杜絕了感染,降低了變態(tài)反應(yīng)。PPP的主要成分是纖維蛋白原(fibrinogen)、纖維連接蛋白(fibronectin)、凝血因子Ⅷ和凝血酶(thrombin),PPP的生物學(xué)作用除了參與止血和凝血以外,還可作為細(xì)胞的附著載體[4-5]具有網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞的作用,同時(shí)能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的有絲分裂[6],但是,PPP在促人牙槽骨成骨細(xì)胞在病變根面上的附著、增殖方面目前還不甚明了,且在牙周再生領(lǐng)域的研究鮮有報(bào)道。

鑒于此,本實(shí)驗(yàn)探討了PPP及根面脫礦單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對牙槽骨成骨細(xì)胞在病變牙根面的附著和增殖的影響,為它們在牙周病治療中促牙周再生的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 牙槽骨成骨細(xì)胞來源:遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院外科門診提供,經(jīng)患者同意,選擇年齡在18至30歲因阻生埋伏而拔除的牙齒,X線顯示無根尖病變、無牙槽骨吸收,收集手術(shù)中去除的牙槽骨,用于牙槽骨成骨細(xì)胞的培養(yǎng)。

1.1.2 牙根片來源:正常牙根片選臨床上因正畸拔除的牙齒,X線顯示無根尖病變、無牙槽骨吸收;病變牙根片選擇臨床上因重度牙周病拔除的患牙。在牙齒拔除前用鉛筆沿釉牙骨質(zhì)界至牙周袋底做標(biāo)記,此范圍為牙周病累及的根面區(qū)。拔除過程中注意不損傷根面,牙拔除后立即用生理鹽水沖洗后,置于生理鹽水中準(zhǔn)備進(jìn)行根片制備。

1.1.3 主要試劑與儀器:膠原酶P(Boehringer Mannheim公司,德國),胎牛血清(TBD生物技術(shù)發(fā)展中心天津),胰蛋白酶 、DMEM培養(yǎng)液(Sigma美國),MTT(Biomol,USA),掃描電鏡(AMRAY 1 000B,美國)。

1.2 方法

1.2.1 牙槽骨成骨細(xì)胞培養(yǎng):取阻生埋伏拔牙時(shí)需要去除的牙槽骨,去除牙槽骨粘骨膜后置于含膠原酶P的培養(yǎng)液中37℃消化2 h,采用組織塊培養(yǎng)法,將牙槽骨組織在培養(yǎng)液浸潤下用金冠剪剪成1 mm3左右的小塊,將組織塊移入25 mL的培養(yǎng)瓶,,加入少量的含20%小牛血清、100 μ/mL青霉素、100 μ/mL 鏈霉素、20 mmol/LHepes的DMEM培養(yǎng)液,在37℃,5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)從組織游出的細(xì)胞鋪滿瓶底約80%時(shí),用0.25%的胰酶消化進(jìn)行傳代,利用免疫組化及堿性磷酸酶活性測試作細(xì)胞來源鑒定,至第5～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 牙根片的制備:病變牙根片選門診擬拔除的患牙周病的牙(松動Ⅲ度以上,附著喪失大于5 mm),根表面標(biāo)記出牙周袋累及的范圍,然后用刮治器刮凈病牙根面上殘留的組織,并在冷水冷卻的條件下用金剛砂片將牙根磨成 4 mm×4 mm、厚1 mm(只磨除牙本質(zhì)側(cè),牙骨質(zhì)側(cè)不磨)的根片,去離子水徹底清洗,高壓蒸汽消毒后,浸于DMEM培養(yǎng)液中,4℃冰箱保存,48 h后待用。

1.2.3 PPP[7]的制備:PPP制作全過程嚴(yán)格無菌,取新鮮全血(已加入抗凝劑),離心1 300 rpm,10 min,之后用63 mm鈍針頭和10 mL注射器抽取淡黃色上層液,即為PPP,留存-20℃冰箱待用。

1.2.4 細(xì)胞附著:實(shí)驗(yàn)分組為未處理病變根片組、PPP包被病變根片組、病變根片脫礦組、PPP包被脫礦的病變根片組;用雙面膠(3×3 mm2)將所有根片按實(shí)驗(yàn)分組固定于48孔培養(yǎng)板底部,每組設(shè)3個(gè)樣本,紫外線照射2 h。根片脫礦處理采用24%的EDTA,pH6.7,脫礦2 min[8],PPP包被組用20 μ L的PPP處理根面。每孔等量接種第5～8代人牙槽骨成骨細(xì)胞(3×104/mL)細(xì)胞懸液 0.5 mL,再于每孔中加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液0.5 mL,標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育24 h,收集并計(jì)數(shù)根片上每平方毫米附著的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:實(shí)驗(yàn)分組與方法同前,標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下分別培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)液,PBS沖洗2次,去除未附著細(xì)胞,掃描電鏡常規(guī)樣品制備,觀察在不同處理組病變根面上附著的牙槽骨成骨細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.6 細(xì)胞增殖:實(shí)驗(yàn)分組與方法同前,標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下分別培養(yǎng)24 h和48 h。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),分別取出根片放入48孔板中,用200 μ L的0.25%的胰蛋白酶充分消化5 min,加入MTT(5 mg/ml)20 μ L,標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下繼續(xù)孵育4 h,再加入150?l的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)不斷震蕩15 min,用ELX800酶聯(lián)免疫檢測儀在λ=490 nm下讀取光密度值。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞附著

圖1 OB附著于病變根面(掃描電鏡 1 000倍)

牙槽骨細(xì)胞在不同處理病變根面上的附著情況,見表1、圖1。與未處理組相比,PPP組及根面脫礦組均能促進(jìn)人牙槽骨成骨細(xì)胞對病變根面的附著(P<0.05),二者聯(lián)合處理促細(xì)胞附著效果明顯增強(qiáng)(P<0.01),PPP處理和根面脫礦處理兩者比較細(xì)胞對病變根面的附著無明顯差異(P>0.05),與單獨(dú)經(jīng)PPP處理和根面脫礦處理相比,PPP和根面脫礦聯(lián)合處理促細(xì)胞附著效果明顯增強(qiáng)(P<0.01)。

表1 牙槽骨細(xì)胞在不同處理病變根面上的附著(24 h)

2.2 細(xì)胞增殖

牙槽骨成骨細(xì)胞在不同處理病變根面上分別體外培養(yǎng)48 h與培養(yǎng)24 h增殖比較情況,見表2、圖2。未處理組中人牙槽骨成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)48 h與培養(yǎng)24 h相比,細(xì)胞在病變根片上的無增殖(P<0.05);單獨(dú)PPP或脫礦處理組中人牙槽骨成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)48 h與培養(yǎng)24h相比,細(xì)胞在病變根片上的增殖稍增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),PPP和根面脫礦聯(lián)合處理組中細(xì)胞在病變根片上的增殖明顯增加(P<0.05)。

表2 在不同處理病變根面上的增殖比較(24 h和48 h)

2.3 掃描電鏡觀察結(jié)果

病變牙根面的蜂窩狀微孔幾乎被菌斑、細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物所覆蓋;病變根面脫礦后又恢復(fù)近似正常根面的結(jié)構(gòu)特征;附著于經(jīng)脫礦或(和)PPP處理后的病變根片上的細(xì)胞與根面附著緊密,并有不同程度的胞體增大、胞漿突擴(kuò)展,有的伸出絲狀偽足(見圖1-4)。

圖2 OB附著于脫礦的病變根面(掃描電鏡 1 000倍)

圖3 OB附著于PPP包被的病變根面(掃描電鏡 1 000倍)

圖4 OB附著于PPP包被的脫礦病變根面(掃描電鏡 1 000倍)

3 討 論

牙周組織再生過程中,細(xì)胞在牙根面這一特定結(jié)構(gòu)和環(huán)境上附著和增殖是進(jìn)一步發(fā)揮生物學(xué)功能的必備條件。

以往的研究證實(shí),牙周組織病變的牙根部牙骨質(zhì)內(nèi)有細(xì)菌、毒素的侵入(參考文獻(xiàn)),使得根面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而不利于牙周組織細(xì)胞的附著和增殖,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,未處理組牙槽骨成骨細(xì)胞的附著明顯低于實(shí)驗(yàn)組,增殖受到抑制,電鏡顯示細(xì)胞在根面的生長狀況也較差。而病變根面經(jīng)脫礦處理后,細(xì)胞的附著增加,是因?yàn)槿コ烁娴溺栉蹖?一定程度降解病變根面的內(nèi)毒素,同時(shí)使一些利于細(xì)胞生長、附著的骨鈣蛋白(OC)及骨涎蛋白(BSP)等非膠原蛋白得以暴露[9-11],Davenport[12]等的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。在經(jīng)PPP處理后,PPP中的主要成分纖維蛋白原和纖維連接蛋白等作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分,發(fā)揮了網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞的作用,介導(dǎo)和促進(jìn)牙槽骨成骨細(xì)胞的趨化、黏附,并對牙槽骨細(xì)胞的生長起到積極作用。尤其在經(jīng)聯(lián)合處理后,附著及增殖顯著增加,電鏡觀察顯示出細(xì)胞形態(tài)較豐滿,突起伸展較充分,有的有偽足伸出。

隨著體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞在聯(lián)合處理的病變根面增殖顯著,可能因?yàn)槁?lián)合處理既去除了根面玷污層、降解根面毒素,還利用PPP本身的特性將細(xì)胞吸附于根面并在其中的生物活性成分作用下促進(jìn)細(xì)胞的增殖。由于本實(shí)驗(yàn)只檢測了24 h和48 h細(xì)胞的增殖效應(yīng),其遠(yuǎn)期細(xì)胞增殖效應(yīng)還有待進(jìn)一步探索。

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