李 詠,趙丹梅,歐陽俊,向 梅,馬文琴,吳超英,史文忠,唐正華

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院,1.普婦科,2病理科,江蘇常州,213003)

在正常月經(jīng)周期中,輸卵管的腺上皮和子宮內(nèi)膜一樣在雌孕激素的作用下會(huì)發(fā)生周期性變化。在子宮內(nèi)膜的種植窗期,有許多因子和激素參與胚胎的種植,其中雌二醇(E2)和孕酮(P)是胚胎植入過程中起主導(dǎo)作用的激素。而輸卵管妊娠的發(fā)病機(jī)制目前還未明確。本實(shí)驗(yàn)研究E2、P和白血病抑制因子(LIF)及其受體(LIFR)與輸卵管妊娠(TP)的關(guān)系,以揭示發(fā)生輸卵管妊娠的分子水平機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)方法和評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.1 病例選擇

從2008年至2010年在江蘇省常州市婦幼保健院收集了57例病例,其中非孕組:健康的未孕婦女(對(duì)照組)11例,年齡 16～46歲,平均(39.3±8.5)歲,均自愿行絕育手術(shù);宮內(nèi)妊娠組:正常的宮內(nèi)妊娠(NIUP)12例,27～40歲,平均(34.5±4.1)歲,均自愿行人工流產(chǎn)或者孕足月剖宮產(chǎn)時(shí)絕育,既往均無自然流產(chǎn)、異位妊娠或激素治療史;TP組:輸卵管妊娠(TP)者 36例,22～43歲,平均(33.9±5.6)歲,每例患者均經(jīng)手術(shù)和病理切片檢驗(yàn)證實(shí),術(shù)前均未行藥物保守治療。3組均選用種植部位的組織切片,種植部位的組織切片評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為:①有錨定絨毛移行穿入輸卵管筋膜層;②有與錨定絨毛穿入相連的正常輸卵管勃膜上皮。同時(shí)收集32例正常宮內(nèi)孕孕婦[孕25～57 d,平均(42±1.6)d]、40例異位妊娠孕婦[孕35～72 d,平均(49.9±1.5)d]血清以檢測(cè)E2、P(兩者孕周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05)。所有患者均簽署知情同意書并且通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。各組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 標(biāo)本來源

①外周血的獲取:于手術(shù)當(dāng)天抽取空腹肘靜脈血3 mL,分離血清,檢測(cè)E2、P。②3組婦女輸卵管組織均在手術(shù)時(shí)(輸卵管妊娠手術(shù)和輸卵管結(jié)扎手術(shù))收集,生理鹽水沖洗后,10%甲醛固定,石蠟包埋,切片(4 μ m),以備免疫組化分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

雌二醇和孕酮診斷試劑盒(德國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司);羊抗人LIF多克隆抗體[LIF(N-18):Sc-1336]和兔抗人LIFR多克隆抗體[LIFR(C-19):Sc-659](美國 Santa Cruz公司);過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白索(SP)染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

①采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)患者外周血血清E2、P;②免疫組化半定量分析(IRS):采用鏈霉素親和素-生物素復(fù)合物方法(SABC)。陰性對(duì)照均采用磷酸緩沖液(PBC)代替一抗,嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)

免疫組化結(jié)果判定綜合考慮切片中陽性細(xì)胞占所觀察同類的細(xì)胞數(shù)的百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項(xiàng)指標(biāo),半定量判定結(jié)果。①根據(jù)顯色程度判斷陽性程度:標(biāo)本無色為0分,淡黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分;②根據(jù)陽性細(xì)胞在觀察細(xì)胞中所占的比例:陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分,陽性細(xì)胞數(shù)11%～50%為2分,陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分,陽性細(xì)胞數(shù)>75%為4分。

2 結(jié) 果

2.1 宮內(nèi)妊娠組和輸卵管妊娠組血清E2、P比較

用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)32例正常宮內(nèi)孕組、40例異位妊娠組血清E2、P,結(jié)果顯示輸卵管異位妊娠組血清E2低于正常宮內(nèi)妊娠組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1A);輸卵管異位妊娠組血清P低于正常宮內(nèi)妊娠組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖1B)。

圖1 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)正常早期宮內(nèi)妊娠組和輸卵管異位妊娠組雌二醇和孕酮的差異

2.2 免疫組化檢測(cè)LIF和LIFR在正常對(duì)照組、宮內(nèi)妊娠組及異位妊娠組輸卵管組織的表達(dá)率和定位

免疫組化檢測(cè)11例非孕組、12例宮內(nèi)妊娠組及36例異位妊娠組其輸卵管組織LIF和LIFR的表達(dá)。結(jié)果顯示,LIF和LIFR在輸卵管腺上皮細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng),在間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較弱,且主要定位于腺上皮細(xì)胞胞漿(圖2)。

圖2 LIF和LIFR在輸卵管組織LIF和LIFR陽性表達(dá)SP法 (400倍)

2.3 半定量分析LIF和LIFR在正常對(duì)照組、宮內(nèi)妊娠組及異位妊娠組輸卵管組織的表達(dá)差異

半定量分析發(fā)現(xiàn),雖然LIF在異位妊娠組的表達(dá)略高于正常對(duì)照組和宮內(nèi)妊娠組,但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A,P>0.05);LIFR在異位妊娠組的表達(dá)明顯高于前兩組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B,P<0.05),正常對(duì)照組和宮內(nèi)妊娠組間無明顯差異(圖3B,P>0.05);但是在間質(zhì)中,LIFR的表達(dá)在輸卵管妊娠組明顯低于其他兩組(P<0.01),而非孕組和宮內(nèi)妊娠組上皮間其表達(dá)無明顯差異(圖3C,P>0.05)。

圖3 半定量分析LIF和 LIFR在各組輸卵管組織的表達(dá)差異

2.4 血清E2、P與輸卵管 LIF、LIFR相關(guān)性分析

分析表明輸卵管妊娠時(shí)血清E2與輸卵管腺上皮和間質(zhì)LIFR均有顯著相關(guān)性。血清E2與腺上皮LIFR之間正相關(guān)(r=0.354,P<0.05),血清E2與間質(zhì)LIFR之間負(fù)相關(guān)(r=-0.397,P<0.01);而血清P與輸卵管妊娠腺上皮和間質(zhì)的LIF、LIFR的表達(dá)無顯著相關(guān)性;血清E2與腺上皮和間質(zhì)的LIF表達(dá)無顯著相關(guān)性。

3 討 論

95%的異位妊娠發(fā)生在輸卵管,雖然輸卵管炎癥、局部解剖結(jié)構(gòu)的改變是發(fā)病的主要原因,但是55%的輸卵管妊娠患者經(jīng)肉眼檢查輸卵管是正常的,因此異位種植的基礎(chǔ)分子機(jī)制仍不明確[1]。本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)LIF及其受體LIFR在輸卵管中的表達(dá),檢測(cè)患者血清E2、P,探討血清 E2、P與 LIF及LIFR與TP的關(guān)系。

在雌激素的作用下,輸卵管黏膜上皮纖毛細(xì)胞生長(zhǎng),體積增大,雌激素還促進(jìn)輸卵管發(fā)育及輸卵管肌層節(jié)律性收縮的振幅。而孕激素則能增加輸卵管的收縮速度,減少輸卵管的收縮頻率、振幅。雌、孕激素的協(xié)調(diào)作用,使輸卵管上皮適應(yīng)月經(jīng)周期變化并保證宮內(nèi)受孕的成功[2]。排卵后子宮內(nèi)膜隨之發(fā)生的復(fù)雜改變,依賴于體內(nèi)包括甾體激素在內(nèi)的多種因素的調(diào)節(jié),最終使內(nèi)膜與胚胎發(fā)育同步化,以利于胚泡著床和進(jìn)一步發(fā)育[3-4]。Pulkkinen等[5]對(duì)輸卵管肌層電生理進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)低孕酮水平下,輸卵管呈現(xiàn)功能障礙的特征。這些基本特征包括:①輸卵管傘端傾向子宮的肌電活動(dòng)低下,向子宮的推進(jìn)力較弱,可導(dǎo)致不孕或?qū)m外孕(不過在運(yùn)輸卵子方面?zhèn)愣损つだw毛的擺動(dòng)可能比肌層的機(jī)械作用扮演更重要的角色);②輸卵管肌電爆發(fā)波的產(chǎn)生率低(推進(jìn)力弱);③無推進(jìn)作用的正弦波和靜止波的發(fā)生率高,不能維持良好的輸卵管機(jī)械推進(jìn)力,可致卵子、受精卵停留。這一研究結(jié)果與一些學(xué)者的流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)相吻合,即黃體功能低下與高異位妊娠發(fā)病率之間有一定關(guān)聯(lián)。他們研究發(fā)現(xiàn)[5],異位妊娠患者外周血孕激素水平普遍較正常妊娠者為低,兩者共同作用使得輸卵管蠕動(dòng)異常,受精卵容易在此發(fā)生滯留。這些資料揭示,血清低孕酮水平,輸卵管局部肌層孕激素受體含量低下,使輸卵管輸送受精卵功能障礙,導(dǎo)致桑葚胚異位植入,是輸卵管妊娠的可能因素。我們的研究也提示異位妊娠組的血清E2、P明顯低于正常宮內(nèi)妊娠組(P<0.05,P<0.01)。異位妊娠患者體內(nèi)雌二醇和孕酮水平低,導(dǎo)致輸卵管平滑肌收縮節(jié)律下降、纖毛向?qū)m腔方向擺動(dòng)減慢、輸卵管峽部無法放松,孕卵運(yùn)行受阻,使胚泡異位種植。

胚胎著床是一種復(fù)雜的生理過程,同時(shí)受諸多因素調(diào)節(jié)。其中 LIF是一種多功能多生物學(xué)性細(xì)胞因子,LIF表達(dá)峰值與著床窗時(shí)間一致,是著床的關(guān)鍵因子[6]。一些研究表明[7],LIF對(duì)妊娠的維持有重要作用。LIF可以啟動(dòng)胚泡著床和促進(jìn)胚泡的發(fā)育,且其作用呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。

LIF是Tomida等[8]在1984年首次從白血病細(xì)胞中分離鑒定的,已證實(shí)LIF的異常表達(dá)與多種疾病密切相關(guān),如異位妊娠、腫瘤等[9-10]。LIF受體復(fù)合物由一個(gè)低親和性受體(LIFR)及一個(gè)高親和性受體(gpl30)組成,LIFR還有LIFRα及LIFRβ兩條鏈。LIF先以較低親和力與受體α結(jié)合,然后與gpl30相互作用形成親和力高的復(fù)合物,二聚體形成后gpl30磷酸化,激活Janus酶,磷酸化下游的信號(hào)傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子(stat)蛋白,從而進(jìn)入核內(nèi)激活下游轉(zhuǎn)錄因子,產(chǎn)生一系列的生物效應(yīng)[11]。同時(shí) LIF是唯一能夠激活體內(nèi)stat3的因子,而一些相關(guān)因子如 IL-6、CNTF等雖共用LIFR及gp130受體,卻無此功能[12]。小鼠子宮內(nèi)膜LIFR在分泌期及妊娠早期表達(dá)量高,而gpl30在妊娠早期(3～4 d)表達(dá)量最高。人LIFR及gpl30在整個(gè)月經(jīng)周期內(nèi)均表達(dá),LIFR主要分布于子宮內(nèi)膜腔上皮,gpl30則在腔上皮和腺上皮中均有發(fā)現(xiàn)[13]。這些結(jié)果顯示,表達(dá)于子宮內(nèi)膜中的LIF及其受體于圍著床期表達(dá)升高,LIF可能通過某種途徑為子宮接受胚胎著床作好準(zhǔn)備。作者的研究結(jié)果顯示LIF主要在輸卵腺上皮表達(dá),間質(zhì)幾乎不表達(dá),這與Keltz等[14]的研究結(jié)果一致。

有趣的是,雖然作者的研究結(jié)果表明LIF在各組間無明顯差異,但是其受體LIFR在異位妊娠組輸卵管的腺上皮表達(dá)水平明顯高于宮內(nèi)妊娠組和非孕組(P<0.05),而宮內(nèi)妊娠組和非孕組間無明顯差異(P>0.05)。同時(shí)作者還發(fā)現(xiàn)在輸卵管間質(zhì)LIFR表達(dá)在異位妊娠組明顯低于與宮內(nèi)孕組和非孕組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);宮內(nèi)孕組略高于非孕組,但是兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示LIFR同樣存在于輸卵管的腺上皮和間質(zhì)中,LIFR在異位妊娠組輸卵管腺上皮的表達(dá)水平明顯高于宮內(nèi)妊娠組和非孕組,而宮內(nèi)妊娠組和非孕組間無明顯差異。這些結(jié)果表明,宮內(nèi)孕組和非孕組輸卵管間質(zhì)LIFR高表達(dá)提示LIFR在正常狀態(tài)時(shí)為儲(chǔ)備狀態(tài),而在輸卵管妊娠狀態(tài)時(shí)大量LIFR游離至輸卵管腺上皮,與LIF一起參與母胎界面生化反應(yīng)。這說明,輸卵管組織 LIFR的異常表達(dá)可能與異位妊娠的發(fā)生密切相關(guān)。從一個(gè)側(cè)面也說明,異位妊娠的發(fā)生不僅需要LIF的表達(dá),同時(shí)也需要LIFR的協(xié)同高表達(dá)。因此,本實(shí)驗(yàn)證明LIF和LIFR是輸卵管妊娠植入的關(guān)鍵因子,同時(shí)檢測(cè) LIF和LIFR的表達(dá)可能成為預(yù)測(cè)異位妊娠發(fā)生傾向性的一組潛在指標(biāo),比單獨(dú)檢測(cè)LIF更有臨床意義。

作者通過血清雌二醇、孕酮和LIF及其受體LIFR的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):輸卵管妊娠時(shí)血清E2與輸卵管腺上皮和間質(zhì)的LIFR表達(dá)均有顯著相關(guān)性。血清E2與腺上皮LIFR之間正相關(guān)(r=0.354,P<0.05),血清E2與間質(zhì)LIFR之間負(fù)相關(guān)(r=-0.397,P<0.01);而血清P與輸卵管妊娠腺上皮和間質(zhì)的LIF、LIFR的表達(dá)無顯著相關(guān)性;血清E2與腺上皮和間質(zhì)的LIF表達(dá)無顯著相關(guān)性。提示E2能上調(diào)輸卵管腺上皮的LIFR表達(dá),下調(diào)輸卵管間質(zhì)LIFR的表達(dá)。

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