殷建瑞，謝富華，解龍昌，高 聰

（廣州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，廣東廣州510260）

急性腦梗死后首先引起一系列炎癥反應，釋放大量細胞因子、趨化因子、黏附因子和蛋白水解酶等，加重腦組織損傷［1］。腦內(nèi)固有免疫的激活需要TLRs、TLR4及TAK1來激活NF-κB等信號轉(zhuǎn)導途徑，表達許多炎性細胞因子，從而加重腦缺血性損傷［2-3］。本研究通過檢測急性腦梗死患者TLR4及TAK1表達的變化探討其與炎性反應機制的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

50例急性腦梗死病例均為我院2009年1月-2010年12月神經(jīng)內(nèi)科住院的首次發(fā)病患者，發(fā)病6 h～24 h入院，符合第4屆全國腦血管病會議修訂的急性腦梗死診斷標準，并經(jīng)頭顱CT或MRI證實，平均年齡（55.37±12.48）歲。另選健康體檢者30例（均除外頸動脈粥樣斑塊形成）作為健康對照組，平均年齡（60.12±9.37）歲。

1.2 排除標準

兩組病例均排除近4 w感染性、免疫性疾病，腫瘤，慢性阻塞性肺部疾病，外周血管性疾病，心力衰竭，心房顫動，肝腎功能不全等。除此之外，急性腦梗死組還應排除：①心源性腦栓塞或其他原因的腦栓塞；②復發(fā)的缺血性腦卒中；③瘤性腦卒中。

1.3 方法

所有病例均進行常規(guī)資料登記（包括病史、生命體征、既往病史），血常規(guī)及生化檢查包括血糖、血脂、C-反應蛋白、血白細胞、分葉細胞比例、血小板、梗死病灶大小，其中梗死灶的測定方法采用有病灶的頭顱 CT 進行測量，計算公式為（0.5×a×b×c），其中a為最大長徑、b為最大橫徑、c為10 mm的梗死薄片切割值，所有的CT掃描均由神經(jīng)?？漆t(yī)師進行雙盲評估。在入院24 h內(nèi)進行神經(jīng)功能缺陷評分（采用NIHSS評分系統(tǒng)）。TLR4及TAK1檢測：取血4 mL以密度梯度離心法獲取外周血白細胞，以Trizol法提取外周血白細胞，總RNA為模板，以SYBRRGREE設計引物，由上?；ど锕こ碳夹g服務有限公司合成，逆轉(zhuǎn)錄酶為MMLV（美國Invitrogen公司）。合成的cDNA稀釋后取適量以熒光定量PCR法進行TLR4、TAK1及β-actin檢測。擴增產(chǎn)物取每個反應體系6 μL，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結果在凝膠成像分析系統(tǒng)中分析泳帶的平均場密度面積值，以此值表示相應基因的表達強度。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學處理。各組間的兩兩比較通過t檢驗分析，并應用多元逐步回歸分析確定各研究因素對TLR4的影響。

2 結果

2.1 兩組病例一般臨床特征比較

結果見表1。由表1可以看出，健康對照組與急性腦梗死組年齡、性別、吸煙史、糖尿病病史及高血壓病史之間差異比較無統(tǒng)計學意義；急性腦梗死組患者血糖水平、CRP水平、白細胞計數(shù)、入院時NIHSS評分及腦梗死容積均比健康對照組高，差異比較均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 兩組病例外周血中不同發(fā)病時間TLR4及TAK1的含量變化比較

結果見表2。由表2可以看出，急性腦梗死患者外周血中TLR4及TAK1含量隨病情變化呈增高趨勢，以發(fā)病后第12小時升高最明顯，與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 各因素與急性腦梗死病灶容積的相關性分析

結果見表3。由表3可以看出，腦梗死病灶的容積與糖尿病史、CRP水平、外周血白細胞計數(shù)、入院時NIHSS評分均有相關性；另一方面，腦梗死病灶容積與 TAK1、TLR4（1 h）無顯著相關性，而 TLR4（12 h、24 h）的表達與腦梗死病灶的容積有相關性，同時在校正糖尿病史、CRP水平、NIHSS評分、白細胞計數(shù)影響的基礎上，TLR4（12 h、24 h）的表達與腦梗死病灶的容積仍存在獨立相關性。

3 討 論

腦梗死（cerebral infarction，CI）的發(fā)生及進程涉及到炎癥反應，本研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者白細胞計數(shù)、CRP、血糖水平等均較健康對照組高，且上述指標與腦梗死的梗死灶容積成正相關，與既往研究結論相符。

表1 兩組病例一般臨床特征比較 （±s）

表1 兩組病例一般臨床特征比較 （±s）

梗死容積（CC，r）健康對照組 70.24±9.6 59.3 35.7 26.4 37.6 36.5±2.6 120.47±27.6 6.3±2.1 187.4±32.9 2.7±0.9 2.8±0.74 7.5±3.4急性腦梗死組 71.45±10.38 52.7 42.2 38.8 45.8 36.8±3.3 140.62±28.8 10.7±3.8 233.8±40.7 4.8±2.1 5.2±1.86 64.6±20.3 P 0.512 0.810 0.095 0.083 0.077 0.925 0.016 0.047 0.663 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001組別 年齡（歲）男性（%）吸煙史（%）糖尿病史（%）高血壓病史（%）體溫（℃）血糖水平（mg/dL）白細胞（×103/mL）血小板（×103/mL）CRP（mg/dL）NIHSS（入院時，分）

表2 兩組病例外周血中不同發(fā)病時間TLR4及TAK1的含量變化比較 （±s）

表2 兩組病例外周血中不同發(fā)病時間TLR4及TAK1的含量變化比較 （±s）

注：與本組 1h 比較，1）P＜0.01

組別 TLR4 TAK1 1 h 12 h 24 h 1 h 12 h 24 h急性腦梗死組 4.57±1.21 7.23±2.541） 5.88±2.071） 20.38±4.56 37.40±6.851） 34.83±5.611）健康對照組 - 1.69±0.78 - - 13.27±4.29 -

表3 各因素與急性腦梗死病灶容積的相關性分析

TLR4是細菌LPS的受體；在LPS誘導的信號傳導中起重要作用，TLR4通過協(xié)同分子CD14、LPS結合蛋白LBP和MD2的共同作用經(jīng)由MyD88、TRAF-6絲裂原活化的蛋白激酶MAPK等信號傳導途徑，將LPS傳導通路的信號迅速傳至核內(nèi)，激活核因子NF-κB通路和相關細胞因子的表達，釋放促炎性細胞因子，激活特異性免疫應答，在機體的先天性和獲得性免疫中起重要作用［4］。近年來的研究顯示免疫系統(tǒng)的介入和多種細胞因子的大量釋放在急性腦梗死的病情演變過程中起著至關重要的作用［5］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在急性腦梗死的患者外周血可見TLR4表達明顯升高，其表達隨病情的嚴重程度呈現(xiàn)增高趨勢。同時，TLR4表達在發(fā)病12 h、24 h與腦梗死病灶的容積有相關性，經(jīng)校正糖尿病史、CRP、白細胞計數(shù)等影響因素后仍存在獨立相關性。由此說明，TLR4參與了急性腦梗死的發(fā)病過程，至少能夠成為急性腦梗死患者的一種生物標記物。

TAK1是一種激酶，是一種參與調(diào)節(jié)各種細胞活動的信號蛋白。TAK1能夠激活兩種特異性的蛋白質(zhì)——NF-κB和JNK，這兩種蛋白質(zhì)與機體免疫、炎癥、細胞程序性死亡以及癌癥的發(fā)生有關［6］。最初對TAK1的描述是在骨發(fā)育過程中，TAK1在轉(zhuǎn)化生長因子beta和骨形成蛋白（BMP）信號轉(zhuǎn)導中起作用。但研究逐漸證明，它在TLR信號轉(zhuǎn)導中也起著非常重要的作用。在IL-1信號傳導研究中顯示，TAK1與一個特殊的激活因子-TAK1結合蛋白（TAB1）共同激活 NF-κB 誘導激酶（NIK）和 IκB 激酶（IKK）［7］。實驗已證明，在 TLR4 啟動的 LPS 信號轉(zhuǎn)導過程中，TAK1的重要作用不僅是激活NF-κB，而且通過激活p38MAPK和JNK，對MKKK具有調(diào)節(jié)作用，從而調(diào)節(jié)炎癥反應過程下游因子的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者TAK1含量明顯升高，然而，并沒有發(fā)現(xiàn)TAK1的含量與腦梗死的梗死容積有任何相關性。因此只能說明TAK1參與了腦梗死發(fā)病的炎癥反應機制，作為一種新的治療靶點仍不明確。

總之，TLR4及TAK1在急性腦梗死發(fā)病的炎性反應機制的病理生理過程中發(fā)揮了作用，TLR4可作為腦梗死的治療靶點，然而尋找新的治療藥物仍需進一步研究。

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