劉英杰，李瑩，潘艷艷，鄭麗，劉軍，單風(fēng)平，曹雅明*

( 1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110001 ; 2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110001 )

不同毒力瘧原蟲(chóng)感染早期根治性治療對(duì)再感染體液免疫應(yīng)答的影響

劉英杰1，李瑩2，潘艷艷2，鄭麗2，劉軍2，單風(fēng)平2，曹雅明2*

( 1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110001 ; 2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110001 )

為探討不同毒力瘧原蟲(chóng)感染早期根治性治療對(duì)再感染體液免疫應(yīng)答的影響，用致死型和非致死型約氏瘧原蟲(chóng)感染DBA/2小鼠，感染后3 d進(jìn)行根治性治療，并于初次感染后90 d進(jìn)行再感染。計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率和檢測(cè)再感染前(0 d)和再感染后(1、3、5 d)不同時(shí)間點(diǎn)脾細(xì)胞中活化性B細(xì)胞百分率以及血清中IgG、IgG1和IgG2a水平，結(jié)果顯示，再感染后2組小鼠均出現(xiàn)短暫的低水平蟲(chóng)體血癥，再感染后第3天活化性B細(xì)胞、IgG、IgG1和IgG2a均出現(xiàn)有意義的升高，但在每一相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，2組小鼠的蟲(chóng)體血癥、活化性B細(xì)胞百分率、IgG、IgG1和IgG2a水平均沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果表明，不同毒力瘧原蟲(chóng)感染早期的根治性治療并不影響宿主在再感染時(shí)產(chǎn)生有效的體液免疫應(yīng)答，強(qiáng)毒株原蟲(chóng)感染也能獲得與弱毒株相同的可抵御再感染的能力。

不同毒力瘧原蟲(chóng);根治性治療;再感染;體液免疫應(yīng)答

我國(guó)流行的瘧疾主要由惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)感染所致，但2個(gè)蟲(chóng)種的毒力存在明顯差異，其中前者毒力較強(qiáng)，是導(dǎo)致腦瘧等嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生的主要蟲(chóng)種。瘧疾流行的顯著特征是反復(fù)感染普遍存在。與惡性瘧感染相比，機(jī)體針對(duì)間日瘧感染產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答更為迅速，其抵御再感染的能力也明顯優(yōu)于惡性瘧感染者［1］。這表明原蟲(chóng)毒力差異與抵御再感染的保護(hù)性免疫建立存在密切相關(guān)性。特異性抗體是抵御再感染的主要效應(yīng)分子［2］，但毒力不同蟲(chóng)株感染早期根治性治療后，其在再感染過(guò)程中體液免疫應(yīng)答是否存在差異，目前尚未見(jiàn)明確報(bào)道。致死型約氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium yoelii 17XL，P.y17XL)和非致死型約氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumyoelii 17XNL，P.y17XNL)分別與惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)具有相似的生物學(xué)特性［3］。為此，對(duì)P.y17XL和P.y17XNL感染早期DBA/2小鼠進(jìn)行根治性治療，然后用同種瘧原蟲(chóng)進(jìn)行再感染，通過(guò)對(duì)再感染前后體液免疫應(yīng)答相關(guān)分子水平進(jìn)行檢測(cè)，探討了毒力不同瘧原蟲(chóng)感染早期的根治性治療對(duì)再感染體液免疫應(yīng)答的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材雌性，6～8周齡DBA/2小鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所;P.y17XL和P.y17XNL由日本愛(ài)媛大學(xué)分子寄生蟲(chóng)學(xué)教研室惠贈(zèng)。

1.1.2 藥品與試劑氯喹和青蒿琥脂片分別購(gòu)自上海中西藥業(yè)有限公司和廣西桂林藥業(yè)有限公司;細(xì)胞熒光標(biāo)記抗體、HRP-羊抗鼠IgG(IgG1或IgG2a)及底物均購(gòu)于BD Pharmigen。

1.2 方法

1.2.1 小鼠感染和治療及再感染小鼠經(jīng)腹腔分別接種P.y17XL和P.y17XNL(1×106)寄生的紅細(xì)胞，尾靜脈采血，觀察紅細(xì)胞感染率。初次感染后3 d，經(jīng)口給藥(青蒿琥脂片60 mg/kg，氯喹90 mg/kg)治療，每天1次，連續(xù)3 d，待初次感染后90 d，小鼠用同種瘧原蟲(chóng)再次感染。

1.2.2 血清收集心臟采集再感染前(0 d)和再感染后第1、3、5天小鼠血液。收集血清，待抗體檢測(cè)。

1.2.3 脾細(xì)胞中活化性B細(xì)胞百分率的檢測(cè)無(wú)菌取出上述時(shí)間點(diǎn)小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)脾細(xì)胞終濃度為1×107/mL。每份樣品用Per-CP-conjugated anti-mouse B220和PE-conjugated anti-mouse CD69進(jìn)行雙色分析。在預(yù)先加入封閉抗體的染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1 mL，再加入抗B220-PerCP和抗CD69-PE mAb進(jìn)行表面染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 血清抗體檢測(cè)以P.y17XL和P.y17XNL抗原(10 μg/mL)包被酶標(biāo)板，常規(guī)加入抗血清(1∶100稀釋)、HRP-羊抗鼠IgG(IgG1或IgG2a)、底物、終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm處OD值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，Student’s-t檢驗(yàn)比較各組均值的顯著性差異，P＜0.05為差異顯著(結(jié)果為3次結(jié)果的均值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠再感染后不同時(shí)間的原蟲(chóng)血癥水平

如圖1所示，感染早期根治性治療小鼠在再感染過(guò)程中均出現(xiàn)了短暫的低水平蟲(chóng)體血癥。在再感染后每一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，不同毒力蟲(chóng)株的蟲(chóng)體血癥水平基本相似，并均于攻擊后第6天左右自愈;而未治療初次感染小鼠的蟲(chóng)體血癥水平持續(xù)升高。這表明，毒力不同瘧原蟲(chóng)初次感染早期根治性治療的小鼠對(duì)同種瘧原蟲(chóng)的再感染具有相似的抵抗力。

圖1 P.y17XL和P.y17XNL初次感染和再感染后的蟲(chóng)體血癥水平Fig.1The levels of parasitemia after primary infection and reinfection with P.y17XL and P.y17XNL

2.2再感染前后不同時(shí)間點(diǎn)脾細(xì)胞中活化性B細(xì)胞的百分率

如圖2所示，與未感染的正常小鼠或再感染前小鼠相比，再感染后第3天小鼠脾細(xì)胞中活化性B細(xì)胞百分率即出現(xiàn)了有意義的升高(P＜0.01)，表明再感染前小鼠體內(nèi)存在一定數(shù)量的記憶性B細(xì)胞;但其此后進(jìn)一步升高，則提示除記憶性B細(xì)胞活化外，可能又有一些初始B細(xì)胞開(kāi)始活化。盡管P.y17XL再感染鼠的活化性B細(xì)胞百分率略高于P.y17XNL再感染鼠，但沒(méi)有顯著性差異。這表明毒力不同蟲(chóng)株感染早期根治性治療后，其毒力強(qiáng)弱未使宿主在再感染時(shí)B細(xì)胞的活化水平產(chǎn)生明顯變化。

2.3 小鼠再感染前后不同時(shí)間點(diǎn)特異性IgG和IgG1以及IgG2a水平

如圖3(ABC)所示，與未感染的正常小鼠相比，2種小鼠再感染前血清中即存在高水平IgG、IgG1和IgG2a(*P＜0.05或＊＊P＜0.01);與再感染前相比，感染后第3天這些抗體明顯增加(☆P＜0.05或☆☆P＜0.01)，此后繼續(xù)升高，這與活化性B細(xì)胞百分率的升高完全同步。在每一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，不同毒力蟲(chóng)株感染鼠的這些抗體水平基本相似。

圖2 再感染前后不同時(shí)間點(diǎn)脾細(xì)胞中活化性B細(xì)胞的百分率Fig.2The percentage of actived B cells in spleen cells from mice pre-and post-reinfection with P.y17XL and P.y17XNL at different time points

圖3 小鼠再感染前后不同時(shí)間點(diǎn)特異性IgG和IgG1以及IgG2a水平Fig.3The levels of specific IgG and IgG1 as well as IgG2a in sera from mice pre-and post-reinfection with P.y17XL and P.y17XNL at different time points

3 討論

有資料顯示，間日瘧再感染后的蟲(chóng)荷水平僅為初次感染后的1/10左右，并且患者沒(méi)有明顯的發(fā)熱等臨床表現(xiàn)［4］;與初次感染相比，惡性瘧再感染后的蟲(chóng)荷水平雖有所下降，但多數(shù)感染者仍具有較高的蟲(chóng)荷水平，同時(shí)有明顯的發(fā)熱等臨床表現(xiàn)［5］。這表明，原蟲(chóng)毒力差異與再感染的保護(hù)性免疫效應(yīng)存在密切相關(guān)性。本研究顯示，P.y17XL和P.y17XNL感染早期根治性治療后，其在同種瘧原蟲(chóng)再感染過(guò)程中均出現(xiàn)短暫的低水平蟲(chóng)體血癥，并且2種原蟲(chóng)的蟲(chóng)荷水平基本相同，表明初次感染早期根治性治療后，小鼠獲得了相似的抵御再感染的免疫保護(hù)。特異性IgG是抵御再感染的主要效應(yīng)分子，尤其是IgG2a的免疫保護(hù)效應(yīng)更強(qiáng)［6］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在再感染后每一相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，2組小鼠活化性B細(xì)胞百分率的升高幅度是相似的;IgG、IgG1和IgG2a水平在再感染前均明顯高于正常對(duì)照鼠，并且在再感染后逐漸升高，但無(wú)論是再感染前或再感染后，2組小鼠的IgG、IgG1和IgG2a水平在相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異。有研究證明，強(qiáng)毒株瘧原蟲(chóng)對(duì)宿主的免疫器官具有明顯的損傷和破壞作用［3］;抗原劑量可改變宿主的免疫應(yīng)答類(lèi)型和強(qiáng)度［7-8］。據(jù)此認(rèn)為，當(dāng)P.y17XL和P.y17XNL感染的紅細(xì)胞在外周血出現(xiàn)時(shí)即進(jìn)行根治性治療可使小鼠受到相同蟲(chóng)荷的抗原刺激，同時(shí)也抑制了P.y17XL對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的破壞作用，因此2組小鼠在再感染時(shí)產(chǎn)生相似的免疫保護(hù)。

綜上所述，瘧疾感染早期根治性治療并不影響宿主在再感染時(shí)產(chǎn)生有效的體液免疫應(yīng)答，強(qiáng)毒株原蟲(chóng)感染也能獲得與弱毒株相同的抵御再感染能力。

［1］Michon P，Cole-Tobian JL，Dabod E，et al.The risk of malarial infections and disease in Papua New Guinean children［J］.Am J Trop Med Hyg，2007，76(6):997-1008.

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［8］Freitas do Rosário AP，Muxel SM.Gradual decline in malariaspecific memory T cell responses leads to failure to maintain long-term protective immunity to Plasmodium chabaudi AS despite persistence of B cell memory and circulating antibody［J］.J Immunol，2008，181(12):8344-8355.

Effect of Radical Cure in Early Phase of Primary Infection with Different Virulent Plasmodia on Humoral Immune Response to Homologous Reinfection

LIU Ying-jie1，LI Ying2，PAN Yan-yan2，ZHENG Li2，LIU Jun2，SHAN Feng-ping2，CAO Ya-ming2
(1.Teach.＆Res.Div.of Pathogen Biol.; 2.Teach.＆Res.Div.of Immun.，Coll.of Basic Med.Sci.，China Med.Uni.，Shenyang 110001)

In order to investigate the effect of radical cure in early phase of primary infection with different virulent plasmodia(Vp)on humoral immune response to homologous reinfection，DBA/2 mice were infected respectively with P.y17XL and P.y17XNL parasited erythrocytes，and radically cured on 3 d after infection.The mice were reinfected respectively with P.y17XL and P.y17XNL on 90 d after primary infection，then the level of parasitemia and specific IgG，IgG1 and IgG2a in sera as well as percentage of activated B cells in spleen cells were observed.The results showed that parasitemia in post-reinfection mice was transient and extremely low，and the percentage of activated B cells，specific IgG，IgG1 and IgG2a in these mice began to increase on 3 d of post-reinfection，however，in each testing time point the levels of parasitemia，IgG，IgG1 and IgG2a as well as the percentage of activated B cells from two groups of mice were not significantly different.These results suggested that radical cure in early phase of primary infection with different Vp had less effect on humoral immune response to homologous reinfection，Vp infection，being similar to low Vp infection，could also get the ability to resist reinfection.

different virulent plasmodia;radical cure;reinfection;humoral immune response

R382.3

B

1005－7021(2011)01－0102－04

劉英杰男，醫(yī)學(xué)碩士，副教授。主要從事瘧疾感染與免疫研究。E-mail:lyjcmu@yahoo.com.cn

*通訊作者。E-mail:yamingcao@yahoo.com.cn

2011-01-02;

2011-01-21