呂偉，田實(shí)民

(棗莊市藥品檢驗(yàn)所，山東 棗莊 277102)

酸性染料比色法測(cè)定白芥子中總生物堿的含量

呂偉*，田實(shí)民

(棗莊市藥品檢驗(yàn)所，山東 棗莊 277102)

目的：建立白芥子中總生物堿含量測(cè)定的方法。方法：采用酸性染料比色法測(cè)定白芥子中總生物堿含量。結(jié)果：酸性染料比色法顯色的條件為pH 4.2的緩沖液10 mL，0.04 %的溴甲酚綠溶液2.0 mL，三氯甲烷萃取4次，每次5 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)332 nm。芥子堿硫氰酸鹽在1.696～16.960 μg·mL-1與吸光度呈良好的線性關(guān)系，平均回收率99.75 %，RSD=1.16 %(n=6)。結(jié)論：該方法靈敏度高，準(zhǔn)確性，重現(xiàn)性好。

酸性染料比色法；白芥子；總生物堿；含量測(cè)定

白芥子為十字花科植物白芥SinapisalbaL.的干燥成熟種子，具有溫肺豁痰利氣、散結(jié)通絡(luò)止痛的功能[1]?；瘜W(xué)成分與藥理研究表明，以芥子堿為代表的生物堿類(lèi)成分是其有效部位之一[2-4]，《中國(guó)藥典》采用HPLC對(duì)芥子堿含量進(jìn)行控制[1]。本文首次采用酸性染料比色法，以主要有效成分芥子堿硫氰酸鹽為對(duì)照品，建立白芥子中總生物堿的含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步全面控制白芥子藥材質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2401PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津)，超聲波藥品處理機(jī)(濟(jì)寧金百特電子有限公司)。芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111702-200501)。所用試劑均為分析純。白芥子樣品，購(gòu)自不同產(chǎn)地，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)石俊英教授鑒定為十字花科植物白芥SinapisalbaL.的種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品貯備液制備

精密稱(chēng)取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品10.6 mg，用pH 4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解并定容至25 mL，作為芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品貯備液(濃度424 μg·mL-1)。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密量取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品貯備液0.5，1，2，3，5 mL，用pH 4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋至10 mL，配成5個(gè)濃度的芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取樣品粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入pH 4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液100 mL，超聲處理30 min，用pH 4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液補(bǔ)足損失的重量，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2 mL，置分液漏斗中，加入pH 4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL，0.04 %的溴甲酚綠溶液2.0 mL，用三氯甲烷萃取4次(5，5，5，5 mL)，合并三氯甲烷萃取液，用三氯甲烷定容至25 mL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液2 mL，置分液漏斗中，加入pH 4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL，0.04 %的溴甲酚綠溶液2.0 mL，用三氯甲烷萃取4次(5，5，5，5 mL)，合并三氯甲烷萃取液，用三氯甲烷定容至25 mL，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在332 nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度A為縱坐標(biāo)，芥子堿硫氰酸鹽濃度C為橫坐標(biāo)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=4.987 0×10-2C+7.551 5×10-2，r=0.999 8。表明芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品濃度在1.696～16.960 μg·mL-1與所形成的酸性染料離子對(duì)的吸光度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液(濃度42.4 μg·mL-1)2 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，在332 nm處連續(xù)6次測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD=0.08 %，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0，20，40，60，80，100，120 min在332 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD=0.15 %，表明供試品溶液在制備后120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取5號(hào)樣品粉末0.5 g，6份，按樣品測(cè)定方法平行測(cè)定，計(jì)算總生物堿含量，RSD=0.19 %。表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取5號(hào)樣品(已知總生物堿含量1.487 %)粉末0.5 g，6份，精密稱(chēng)定，精密加入芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品6.96 mg，按樣品測(cè)定方法操作，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 總生物堿加樣回收率試驗(yàn)

注：芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品加入量均為6.96mg

2.9 樣品中總生物堿含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地樣品粉末0.5 g，按2.3制備供試品溶液，以相應(yīng)試劑為空白。照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在332 nm處測(cè)定吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出濃度C，以干燥品計(jì)算總生物堿含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地白芥子總生物堿含量測(cè)定 /%

注：n=3

3 討論與小結(jié)

現(xiàn)有的總生物堿的含量測(cè)定方法主要有重量法、酸堿滴定法和酸性染料比色法。其中重量法和酸堿滴定法專(zhuān)屬性差，靈敏度低，所需樣品量大。酸性染料比色法測(cè)定中藥中總生物堿的含量，是根據(jù)一定pH值條件下，生物堿鹽的陽(yáng)離子和酸性染料的陰離子定量結(jié)合生成有色的絡(luò)合物(即離子對(duì))，此離子對(duì)可以定量地被某種有機(jī)溶劑萃取的原理，通過(guò)測(cè)定萃取液的吸光度，來(lái)測(cè)定中藥中總生物堿含量的方法[5]。

本文對(duì)酸性染料的種類(lèi)(甲基橙、溴甲酚綠、溴酚藍(lán)、溴麝香草酚藍(lán))、酸性染料的用量、檢測(cè)波長(zhǎng)、水相pH值、緩沖液的用量、試劑加入順序、萃取條件、樣品處理方法等多個(gè)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品與甲基橙形成的絡(luò)合物在200～500 nm無(wú)特征吸收；與溴酚藍(lán)、溴麝香草酚藍(lán)形成的絡(luò)合物及空白溶液在332、415 nm處吸收均較大；與溴甲酚綠形成的絡(luò)合物在332、415 nm處吸收較大而空白溶液在332 nm吸收很小，故選擇溴甲酚綠為顯色的酸性染料；確定檢測(cè)波長(zhǎng)為332 nm。pH 4.0～4.4，芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品與溴甲酚綠形成的絡(luò)合物有比較穩(wěn)定的最大吸光度值，故選擇pH 4.2為顯色的pH值。溴甲酚綠溶液用量在1.5～2.5 mL，芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品與其形成的絡(luò)合物有比較穩(wěn)定的最大吸光度值，故選擇2.0 mL為酸性染料的用量。緩沖液用量在8～12 mL，芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品與溴甲酚綠形成的絡(luò)合物有比較穩(wěn)定的最大吸光度值，故選擇緩沖液的用量為10 mL。以緩沖液-染料-三氯甲烷的順序加入試劑操作，芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品與溴甲酚綠形成的絡(luò)合物有最大的吸光度值，故確定試劑加入順序?yàn)榫彌_液-染料-三氯甲烷。經(jīng)過(guò)3次萃取，三氯甲烷已經(jīng)能將生物堿酸性染料離子對(duì)提取99.9 %以上，為確保提取的充分與完全，確定萃取條件為三氯甲烷萃取4次(5,5,5,5 mL)。樣品超聲提取30 min或回流提取2 h以后，延長(zhǎng)提取時(shí)間，測(cè)得總生物堿含量均不再增加；超聲提取30 min與回流提取2 h的提取效果相當(dāng)；超聲提取更簡(jiǎn)便、省時(shí)，故確定樣品的提取方法為超聲提取30 min。最終確定最佳實(shí)驗(yàn)條件為：溴甲酚綠為顯色的酸性染料，用量2.0 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)332 nm，顯色水相pH 4.2，緩沖液用量10 mL，試劑加入順序?yàn)榫彌_液-染料-三氯甲烷，萃取條件為三氯甲烷萃取4次(5,5,5,5 mL)，樣品提取方法為超聲提取30 min。該方法操作簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好、加樣回收率高、人為誤差小，可以用作白芥子的質(zhì)量控制。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：149-150.

[2] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].上冊(cè).上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：983.

[3] 李晶，石卓，趙麗娟，等.芥子堿硫酸氫鹽對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓和心率的影響[J].吉林中醫(yī)藥，2002，22(6)：55-56.

[4] 張明發(fā)，沈雅琴.芥子堿的抗炎和抗腹瀉作用[J].中藥藥理與臨床，1996，12(1)：29-31.

[5] 蔣愛(ài)芳，楊義芳，黃文武.酸性染料比色法測(cè)定總生物堿的研究進(jìn)展[J].中草藥，2006，37(增刊)：359-362.

DeterminationoftheTotalAlkaloidsinSemenSinapisAlbabyAcidDyeColorimetry

Lü Wei，TIAN Shi-min

(1.ZaozhuangInstituteofDrugControl，Zaozhuang277102，China)

Objective:To investigate the method of determination of total alkaloids in SemenSinapisalba.Methods：The Contents of total alkaloids were determined by Acid dye colorimetry.Results：Acid dye color conditions：pH 4.2 buffer 10 mL，0.04 % bromocresol green liquid 2.0 mL，chloroform extraction four times，each time use 5 mL，and the wavelength was at 332 nm.The linear range of Sinapine thiocyanate was 1.696～16.960 μg·mL-1，the mean recovery was 99.75 %，RSD=1.16 % (n=6).Conclusion：This method is simple，sensitive and accurate with good reproducibility.

Acid Dye Colorimetry; SemenSinapisalba; Total Alkaloids; Determination

*呂偉，E-mail：lvwei0632@126.com

2011-01-07)