俞蘇華，周福富，葉徐英，宋世杰，羅發(fā)松

(1.浙江普洛康裕天然藥物有限公司，浙江 金華 321017; 2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321017;3.浙江金大康動物保健品有限公司，浙江 金華 321000; 4.浙江尖峰藥業(yè)有限公司，浙江 金華 321007;5.福建夢嬌蘭日用化學(xué)品有限公司，福建 漳州 363400)

香菇多糖澄清劑提取法研究

俞蘇華1，周福富2，葉徐英3，宋世杰4，羅發(fā)松5

(1.浙江普洛康裕天然藥物有限公司，浙江 金華 321017; 2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321017;3.浙江金大康動物保健品有限公司，浙江 金華 321000; 4.浙江尖峰藥業(yè)有限公司，浙江 金華 321007;5.福建夢嬌蘭日用化學(xué)品有限公司，福建 漳州 363400)

目的 研究香菇多糖的提取方法，提高多糖含量及提取率，擴大生產(chǎn)可操作性及降低生產(chǎn)成本。方法 采用水提、澄清除雜、高速離心和醇沉等方法提取香菇多糖。結(jié)果 與傳統(tǒng)的水提、Sevag法、醇沉等工藝比較，澄清劑法提取香菇多糖的效果較好。結(jié)論 澄清劑法提取工藝，生產(chǎn)可操作性強，提高了多糖含量及產(chǎn)品提取率，降低了生產(chǎn)成本。

香菇多糖;澄清劑;Sevag提取法

香菇 Lentinus edodes(Berk.)Sing.是著名的食、藥兼用菌，香菇多糖是其中的重要生物活性成分，是一種β－1，3－D葡聚糖。近年來，以吸附澄清劑作為澄清分離的方法在中藥提取工藝中得到了應(yīng)用，它可部分代替中藥水提醇沉工藝，提高有效成分的含量，保證中藥成品質(zhì)量的穩(wěn)定性。目前，應(yīng)用于中藥制劑工藝的澄清劑品種很多，如甲殼素及其衍生物、101果汁澄清劑、聚凝凈、陽和1+1澄清劑、ZTC 1+1天然澄清劑等。文獻報道，ZTC 1+1澄清劑用于眠爾康口服液的澄清工藝，用于生脈飲提取液的精制研究，還有用于氣血雙補口服液澄清研究等。由于ZTC 1+1澄清劑有多種系列，應(yīng)針對不同劑型選擇不同的型號。本試驗選擇ZTC 1+1－Ⅲ(主要針對口服劑型)澄清劑進行研究，報道如下。

1 儀器與試藥

DZF6020型真空干燥箱(杭州藍天化驗儀器廠);2L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司);DW－0.25K型調(diào)溫電熱碗、SHB－B88型水循環(huán)真空泵、HH－雙列四孔數(shù)顯水浴槽等設(shè)備均購自鄭州長城科工貿(mào)公司;5 000 mL圓底燒瓶、冷凝管、燒杯、試管、玻棒、溫度計、比重計等儀器。香菇干(子實體)購自武義金星食用菌有限公司，粗粉碎，待用。苯酚(天津市新精細化工開發(fā)中心)，氫氧化鈉(天津市北辰方正試劑廠)，濃硫酸(太原硫酸廠勞動服務(wù)公司)，無水葡萄糖(北京化工廠)，三氯甲烷(天津市天新精化工開發(fā)中心)，正丁醇(天津市北辰方正劑廠)，均為AR;95%食用酒精(蘭溪中化);碘滴定液(0.05 mol/L)、硫代硫酸鈉溶液(0.1 mol/L)、淀粉指示液等均由公司化驗室配制。

2 方法與結(jié)果

2.1 香菇多糖提取試驗

香菇多糖提取液制備:取香菇粗粉100 g，于圓底燒瓶中，水提(加10倍量的純化水，溫控在40～45℃，5 h)，濾取水提液。重復(fù)水提1次(加8倍量水，3 h)，合并兩次提取液進行減壓濃縮，濃縮至比重約為1.1(25℃)，備用。

Sevag法除蛋白處理:將上述濃縮液中加入其體積1/5的三氯甲烷－正丁醇(4∶1)溶劑 ，合并于分液漏斗中，激烈振蕩35 min，靜置，分離水相。重復(fù)上述操作3次，得萃取液。邊攪拌邊加入95%酒精，至多糖液中的醇量達到70%(m/m)，充分攪勻，靜置過夜，過濾沉淀物，進行真空干燥，最后得干燥物4.67 g(表面呈黑色，里呈灰黃色)。

2.2 澄清劑使用方法選擇試驗

選擇山東藥圣及天津正天成生產(chǎn)的ZTC 1+1－Ⅲ澄清劑進行對比研究。

澄清劑配制:按ZTC 1+1－Ⅲ澄清劑使用說明書配制澄清劑，備用。取200 g香菇粗粉，照2.1.1項下方法制備水提液，減壓濃縮至比重1.02(25℃)，備用。取10支刻度試管，各量取50 mL藥液，隨機編號1－10，將奇數(shù)管中加入600×10－6(為每10 000 L待處理藥液中加入600 kg澄清劑)澄清劑B(山東藥圣)，偶數(shù)管各加入600×10－6澄清劑B(天津正天成)，于90℃水浴中處理30 min，各加入相應(yīng)品種的300×10－6澄清劑A，于90℃水浴中處理20 min，過濾沉淀物，干燥，稱重。澄清處理過程中均需攪拌，以下同。結(jié)果奇數(shù)管(山東藥圣)中沉淀物質(zhì)量分別為 1.275，1.268，1.270，1.28 g，平均1.275 g;偶數(shù)管(天津正天成)中沉淀物質(zhì)量分別為1.146，1.157，1.148，1.159，1.162 g，平均 1.154 g?？梢?，山東藥圣產(chǎn)澄清劑的除雜量多于天津正天成的，高出約10%。因此，選擇山東藥圣產(chǎn)的ZTC 1+1－Ⅲ澄清劑進行以下試驗。

澄清劑使用方法:取濃縮液50 mL，共4份，放入試管中，置90℃水浴，各加入 600 ×10－6澄清劑 B，分別處理 20，30，40，50 min;各加入 300 × 10－6澄清劑 A，分別處理 20，30，40，50 min，過濾沉淀物，干燥稱重。結(jié)果見圖1?？梢姡吻逄幚頃r間為30～40 min時效果較好?？紤]到生產(chǎn)成本，確定澄清處理時間為30 min。

圖1 不同沉淀時間的沉淀效果

澄清劑用量:取濃縮液50 mL，共4份，放入試管中，置90℃水浴，各加入澄清劑 B，用量分別為 200 ×10－6，400 ×10－6，600 ×10－6，800×10－6，澄清處理時間為30 min;各加入澄清劑A，用量分別為 100 ×10－6，200 ×10－6，300 ×10－6，400 ×10－6，澄清處理時間為30 min;最后過濾沉淀物，干燥稱重。結(jié)果見表1?？梢?，澄清劑用量與產(chǎn)生的沉淀物質(zhì)量間存在一定的比例關(guān)系，考慮生產(chǎn)成本，選擇澄清劑用量為600×10－6澄 清 劑 B+300×10－6澄清劑 A。

表1 澄清劑用量考察結(jié)果

澄清處理溫度:取濃縮液50 mL，共3份，放入試管中，分別置于75，85，95℃水浴中，各加入600×10－6澄清劑B，澄清處理時間為30 min;各加入300×10－6澄清劑A，澄清處理時間為30 min;最后過濾沉淀物，干燥稱重。結(jié)果見圖2?？梢?，澄清處理溫度在85～95℃時效果較理想。結(jié)合生產(chǎn)實際，選擇澄清處理溫度為85～90℃之間，溫差為±5℃，便于生產(chǎn)操作。

圖2 不同工藝溫度的沉淀效果對比

最佳澄清工藝:綜合試驗結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)實際，澄清劑用量為600×10－6B+300×10－6A，處理時間30 min，處理溫度 85～90℃。

2.3 醇沉試驗

取100 mL濃縮液，按最佳工藝澄清處理得澄清液，減壓至比重約為1.1(25℃)，待用。取濃縮液50 mL，共5份，放入試管中，分別加入95%酒精至不同的醇含量，進行沉淀處理，靜置過夜，過濾沉淀物，干燥稱重，并測定多糖含量。結(jié)果見表2?？梢姡尤?5%酒精至濃縮液中的醇含量為80%以上時，其多糖提取率達最大值。結(jié)合生產(chǎn)實際，考慮生產(chǎn)成本，選擇80%的醇含量。

表2 醇沉試驗結(jié)果

2.4 最佳澄清工藝驗證試驗

按確定的最佳工藝，生產(chǎn)3批樣品，考察最佳澄清工藝。結(jié)果顯示，其工藝生產(chǎn)中糖提取量穩(wěn)定(表3)。

表3 最佳工藝驗證試驗結(jié)果(n=5)

2.5 含量測定及質(zhì)量檢查

單糖測定:取本品約0.2 g，精密稱定，加熱水60 mL，振搖使溶解，冷卻至室溫后，精密加入碘滴定液(0.05 mol/L)10 mL，搖勻，逐滴加入氫氧化鈉試液4 mL，邊加邊振搖，密塞，放置暗處10 min，加稀硫酸4 mL，立即用硫代硫酸鈉液(0.1 mol/L)滴定，至近終點時，加淀粉指示液2 mL，繼續(xù)滴定至藍色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每1 mL碘滴定液(0.05 mol/L)相當于9.008 mg的C6H12O6。結(jié)果批號為20071101的產(chǎn)品中單糖含量為7.6%。

多糖測定及標準曲線繪制:精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖0.1 g，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。量取5 mL溶液，置100 mL量瓶中，稀釋至刻度，制成貯備液。分別取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加水稀釋至 1.0 mL ，再加 3% 苯酚溶液 1.0 mL，迅速加入濃硫酸 4.5 mL，搖勻，靜置至室溫，以蒸餾水為空白，在490 nm波長處測定吸光度。結(jié)果批號為20071101的產(chǎn)品中多糖含量為45.1%，折算香菇多糖的提取率為5.92%(多糖含量以30%計)。

穩(wěn)定性試驗:生產(chǎn)的3批產(chǎn)品單糖、多糖含量見表3，質(zhì)量符合標準要求。同時取3批產(chǎn)品進行加樣回收、精密度試驗，結(jié)果的相對標準差(RSD)均符合要求。按藥典規(guī)定條件對3批產(chǎn)品進行加速試驗，并按儲藏條件進行質(zhì)量穩(wěn)定性考察。結(jié)果顯示樣品在2年有效期內(nèi)穩(wěn)定(表4及表5)。

表4 產(chǎn)品加速試驗多糖含量變化情況(%)

表5 產(chǎn)品常溫試驗多糖含量變化情況(%)

3 討論

香菇多糖的提取分離通常采取水提醇沉法，主要是將香菇(子實體)經(jīng)水浸提液浸提，再經(jīng)減壓濃縮、Sevag法去除游離蛋白[加入0.2倍多糖溶液體積的氯仿和正丁醇(4∶1)混合液，振蕩半小時進行分離，直至氯仿與水的界面無沉淀為止，且要重復(fù)處理2～3次才能有效除去多糖中的蛋白質(zhì)][1－2]，得到的多糖產(chǎn)品純度較低，一般為30%左右，且生產(chǎn)工藝較復(fù)雜，導(dǎo)致經(jīng)濟效益低。采用微波法提取香菇多糖[3]，多糖提取率高于傳統(tǒng)熱水法，且提取時間可縮短100倍，但離大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)條件尚有很大的差距，缺乏可靠的工業(yè)生產(chǎn)數(shù)據(jù)。酶解法提取香菇多糖[4]，采用纖維素酶、果膠酶及木瓜蛋白酶作用于香菇的細胞壁，使其破裂，多糖易從細胞內(nèi)釋放，提高了香菇多糖的提取率，有利于進一步的加工;還有采用中性蛋白酶將多糖從蛋白多糖中解離釋放出來，從而提高了多糖的得率，且降低了多糖中蛋白質(zhì)的含量。

由于所得樣品是通過真空干燥后再粉碎而成，故其色澤不如噴霧干燥。通過澄清劑澄清除雜、醇沉等新工藝試制得到的香菇多糖，色澤為淺灰黃色，多糖含量為46%，單糖含量為13%，提取率為7.5%，且產(chǎn)品安全無毒。而舊工藝必須考慮產(chǎn)品的有機溶劑殘留問題(采用Sevage法去除蛋白，使用氯仿和正丁醇)。優(yōu)選的新工藝比提取率升高，澄清劑費用較氯仿、正丁醇低，縮短了生產(chǎn)周期，降低了生產(chǎn)成本。

[1]牛廣財，朱 丹.馬齒莧多糖脫蛋白方法的研究[J].食品研究與開發(fā)，2005，26(5):51－53.

[2]李知敏，王伯初.植物多糖提取液的幾種脫蛋白方法的比較分析[J].重慶大學(xué)學(xué)報，2004，27(8):57－59.

[3]張海容，韓偉珍.微波法與傳統(tǒng)熱水法提取香菇多糖的比較研究[J].食品研究與開發(fā)，2005，26(5):68－71.

[4]謝紅旗，杜邵龍.酶法提取香菇多糖新工藝研究[J].食用菌，2006(4):59－61.

TQ461;R282.71

A

1006－4931(2011)02－0045－02

2009－12－10;

2010－04－28)

俞蘇華(1962－)，執(zhí)業(yè)藥師，主要從事中藥生產(chǎn)技術(shù)研究和制藥生產(chǎn)企業(yè)管理，(電子信箱)yush@apeloa.com。