王 辰，付艷麗，王 振，高云濤

(云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院民族藥資源化學(xué)國家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650031)

環(huán)境激素雙酚A與蛋白質(zhì)相互作用的電化學(xué)研究

王 辰，付艷麗，王 振，高云濤

(云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院民族藥資源化學(xué)國家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650031)

采用電化學(xué)法研究環(huán)境激素雙酚A與牛血清蛋白的相互作用.實(shí)驗(yàn)表明牛血清蛋白存在使雙酚A的氧化峰峰電流減小.雙酚A在加入牛血清蛋白后參與反應(yīng)的質(zhì)子數(shù)和電子數(shù)都為2.牛血清蛋白與雙酚A的結(jié)合數(shù)m=2，結(jié)合常數(shù)β=5.81×1010.由此推測雙酚A進(jìn)入牛血清蛋白的疏水空腔內(nèi)，使游離雙酚A濃度變小.

雙酚A;牛血清蛋白;循環(huán)伏安法;相互作用

雙酚A(BPA)是應(yīng)用廣泛的有機(jī)化工原料［1］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1.具有較強(qiáng)的類雌激素的作用，干擾人類和動物的正常內(nèi)分泌功能［2－3］.近年來的研究表明，雙酚A能改變遺傳信息的某些基因，導(dǎo)致細(xì)胞的畸變，產(chǎn)生腫瘤［4］，具有致癌、致畸、致突變的毒性［4］.蛋白質(zhì)是藥物發(fā)揮藥效的重要載體和靶分子，探討B(tài)PA與蛋白質(zhì)的相互作用對于在分子水平了解BPA的作用機(jī)制具有重要意義［5］.本文利用多壁碳納米管(MWNT)［6－7］修飾玻碳電極(MWNT/GCE)研究了BPA與牛血清蛋白相互的作用，對二者之間的作用機(jī)理進(jìn)行研究，為深入了解BPA類環(huán)境激素的生物毒性提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MEC－12B型多功能電化學(xué)分析系統(tǒng)(江蘇江分電分析儀器有限公司).三電極系統(tǒng):工作電極為修飾玻碳電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對電極為鉑電極，超聲波清洗器AS3120A.

雙酚A(BPA，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司)溶于乙醇配成2.0×10－3mol/L儲備液;多壁碳納米管(廈門大學(xué)提供);牛血清蛋白(BSA，北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所)，用2次重蒸水配成1.0×10－4mol/L儲備液，4℃冰箱保存;KH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液.所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為2次重蒸水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MWNT/GCE的制備

將MWNT在濃HCl中超聲72 h進(jìn)行純化，純化后的MWNT加濃HNO3在140℃下回流8 h，用2次重蒸水洗至中性，在100℃烘干，研成粉末，經(jīng)濃HNO3回流處理后的MWNT，在打開其端口的同時，引入羧基和羥基等官能團(tuán).

稱取功能化的MWNT粉未10.0 mg，超聲分散于10 mL 2次重蒸水中，形成黑色懸濁液備用.玻碳電極先用0.05 μm Al2O3拋光粉拋光成鏡面，然后分別在無水乙醇和2次重蒸水中超聲清洗5 min.用微量進(jìn)樣器取4 μL懸濁液滴加在玻碳電極表面，紅外燈下烘干，即得MWNT/GCE.

1.2.2 循環(huán)伏安法(CV)分析

取一定量的BPA至10 mL比色管，加入KH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液，稀釋至刻度后，轉(zhuǎn)移至電解池中.采用三電極體系，在0.2～0.8 V電位范圍內(nèi)，以0.10～0.40 V/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，記錄伏安曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 電極的選擇

用玻碳電極和多壁碳納米管電極分別進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，以0.15 V/s的掃速速度在0.2～0.8 V范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描發(fā)現(xiàn):BPA在玻碳電極上無氧化還原峰信號;在多壁碳納米管電極上有一靈敏的氧化峰.因此，采用多壁碳納米管電極作為工作電極.

2.2 支持電解質(zhì)的選擇

分別在HAc－NaAc，B－R，KH2PO4－Na2HPO4緩沖體系中進(jìn)行測試，均會出現(xiàn)相應(yīng)的氧化還原峰，但峰電位、峰形、峰電流大小不同.結(jié)果表明BPA在KH2PO4－Na2HPO4緩沖體系中峰形好，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)選用KH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液為測定支持電解質(zhì).

2.3 緩沖溶液酸度的影響

在KH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液(pH 6.0～8.0)，BPA+BSA體系在不同pH條件下，峰電位不變，而峰電流卻有不同程度的降低.電位Ep與pH的關(guān)系結(jié)果見圖2，線性回歸方程 Ep(V)=0.96－0.059 pH，r=0.995 6 .

2.4 反應(yīng)時間對峰電流的影響

BPA與牛血清蛋白相互作用，隨著二者反應(yīng)時間的增加，峰電流有一定的增加(見圖3).當(dāng)相互作用20 min后，峰電流基本穩(wěn)定.因此，選擇BPA與牛血清蛋白相互作用時間20 min.

網(wǎng)絡(luò)空間主權(quán)理念下，網(wǎng)絡(luò)恐怖主義這一非傳統(tǒng)領(lǐng)域的安全威脅構(gòu)成對本國主權(quán)的侵犯，對國家安全產(chǎn)生嚴(yán)重影響，才能迫使國家積極主動對外尋求合作防范網(wǎng)絡(luò)恐怖主義的襲擊。同時各國在行使網(wǎng)絡(luò)空間主權(quán)時應(yīng)秉承互相尊重的理念，防止借網(wǎng)絡(luò)反恐之名干涉別國內(nèi)政。明確網(wǎng)絡(luò)空間主權(quán)，也使得各國打擊網(wǎng)絡(luò)恐怖主義有了明確的分工，有助于建立和平安全有序的網(wǎng)絡(luò)格局。我國政府對網(wǎng)絡(luò)主權(quán)非常重視，在《國家安全法》和《網(wǎng)絡(luò)安全法》中均確立了“網(wǎng)絡(luò)空間主權(quán)”的概念，表達(dá)了我國捍衛(wèi)網(wǎng)絡(luò)空間主權(quán)、積極開展國際合作的態(tài)度和立場。

2.5 掃描速度的影響

2.5.1 掃速對峰電位的影響

對1.0×10－5mol/L BPA和1×10－5mol/L BSA同時存在的溶液進(jìn)行測定，觀察掃速對峰電位的影響.結(jié)果表明，當(dāng)掃速在0.10～0.40 V/s范圍內(nèi)變化時，峰電位均隨掃速的增加而增加，且峰電位Ep與掃速的自然對數(shù)值lnv之間存在著良好的線性關(guān)系，線性方程Ep=0.462+0.0196 lnv，r=0.995 2.

2.5.2 掃速對峰電流的影響

對1.5×10－5mol/L BPA和1×10－5mol/L BSA同時存在的溶液進(jìn)行測定，考察掃速對二者作用完全峰電流的影響.結(jié)果表明，當(dāng)掃速在0.10～0.40 V/s范圍內(nèi)變化時，峰電流均隨掃速的增加而增加，與掃速的平方根成線性，線性方程為Ip=0.074 3+0.088 9 v1/2，r=0.991 6.說明此條件下電極反應(yīng)過程主要受擴(kuò)散控制［7］.

對于只有1.5×10－5mol/L BPA的體系，當(dāng)掃速v在0.05～0.40 V/s之間，無論是峰電位Ep還是峰電流Ip都是與掃速的一次方成正比，氧化峰電流與掃速的關(guān)系式為Ip=23.27v+0.926，r=0.991，說明此時BPA在電極表面上的電極反應(yīng)過程受吸附控制［7］.

2.6 靜止時間的影響

對1.0×10－5mol/L BPA和1×10－5mol/L BSA同時存在的溶液進(jìn)行測定，靜止時間基本對電流沒有影響，本實(shí)驗(yàn)的靜止時間選擇10 s.

2.7 雙酚A與BSA相互作用的電化學(xué)行為

圖4中的曲線為BPA與BSA在MWNT/GCE的循環(huán)伏安譜(CV).由圖4可知，BPA在0.10 mol/L，pH=7.0的KH2PO4－Na2HPO4緩沖液中，有一個氧化峰，其電化學(xué)行為具有典型的不可逆特征，氧化峰電位(Ep)為0.56 V，隨著1×10－5mol/L BSA加入，峰電位基本不變，峰電流減小.

2.8 反應(yīng)的電子數(shù)與質(zhì)子數(shù)求算

參照文獻(xiàn)［8］可知不可逆波峰電位方程式為:

式中α為轉(zhuǎn)移系數(shù)，D為擴(kuò)散系數(shù)，KS為電極反應(yīng)速率常數(shù)，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，n為電子轉(zhuǎn)移數(shù).

又根據(jù)掃速與峰電位的關(guān)系

由式(2)、(3)可以得到:

根據(jù)不可逆吸附體系峰電流Ip與吸附電量Q關(guān)系式:

可測得電極反應(yīng)的電子數(shù)n，式中Q=nFAΓ，為循環(huán)伏安單一過程的峰面積(以電量計)，F(xiàn)為法拉第常量，A為電極面積，Γ為吸附量，R為摩爾氣體常量，T為熱力學(xué)溫度.由上可知，不必知道電極吸附量及電極面積的絕對值，只要測得某掃描速度下CV圖上的面積Q即可求得n.

以不同濃度BPA測得的Ip、Q，由式(5)計算得:n=2，即在電極反應(yīng)中有2個電子參與反應(yīng).又由(4)式得αn值為0.655，所以α =0.328.

又根據(jù)Nernst方程:

由上面n=2，計算得出轉(zhuǎn)移的質(zhì)子數(shù)m=2.03≈2，即參與反應(yīng)的質(zhì)子數(shù)為2.

2.9 BPA與BSA結(jié)合常數(shù)β和結(jié)合數(shù)m

對于BPA－BSA的復(fù)合物，可根據(jù)文獻(xiàn)［9］算出兩者之間的結(jié)合比和結(jié)合常數(shù)，假定BPA與BSA只形成一種簡單的復(fù)合物BSA－mBPA，則結(jié)合反應(yīng)如下:

式中β為結(jié)合常數(shù).

氧化峰電流Ip與BPA濃度及ΔIp與BPA濃度的關(guān)系見圖5.圖中曲線a為沒有加入BSA時BPA的氧化峰電流Ip隨BPA濃度變化的關(guān)系曲線，曲線b為加入1.0×10－5mol/L BSA反應(yīng)后，Ip隨雙酚A濃度變化的關(guān)系曲線，曲線c為曲線a和曲線b的氧化峰電流差值ΔIp(=Ip，a－ Ip，b) 隨 BPA 濃度變化的關(guān)系曲線.

經(jīng)推導(dǎo)可得下式:

式中，ΔIp，max為加入BSA前后氧化峰電流差值的最大值.

［1］STAPLES A C，DORN B P，KKECKA M G，et al.A review of the environmental fate，effects，and exposures of bisphenol A［J］.Chemosphere，1998，36(10):2 149 －2 173.

［2］KASHIWADA S，ISHIKAWA H，MIYAMOTO N，et al.Fish test for endocrine － disruption and estimation of water quality of Japanese rivers［J］.Water Research，2002，36(8):2 161 －2 166.

［3］KIM K B，SEO K W，KIM Y J，et al.Estrogenic effects of phenolic compounds on glucose－6 －phosphate dehydrogenase in MCF－7 cells and uterine glutathione peroxidase in rats［J］.Chemosphere，2003，50(9):1 167 －1 173.

［4］WANG P H.Environmental hormones and their harmful effects［J］.North Environment，2005，30(2):33 －36.

［5］熊何鍵，馬英，汪琳，等.紫外輻射誘導(dǎo)牡蠣細(xì)胞DNA損傷的單細(xì)胞凝膠電泳檢測［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2010，19(6):400 －404.

［6］SUN Y Y，WU K B，HU S S.Voltammetric behaviors of diethylstilbestrol and its determination at multi－ wall carbon nanotubes modified glassy carbon electrode［J］.Acta Pharm Sinica，2003，38(5):364 －366.

［7］DONG S J，CHE G L，XIE Y W.Chemically Modified Electrodes［M］.Beijing:Science Press，2003:54.

［8］BARD A J，F(xiàn)AULKNER L R.Electrochemistry methods:fundamentals and applications［M］.NewYork:John Wiley＆Sons，1980:222.

［9］LABIRON E.General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diffusionlesselectrochemical systems［J］.Journal of Electroanalyticak Chemistry，1979，101(1):19 －28.

(責(zé)任編輯王 琳)

Electrochemical Studies of the Interaction between Environmental Hormone Bisphenol A and Protein

WANG Chen，F(xiàn)U Yan-li，WANG Zhen，GAO Yun-tao
(Key Laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry，State Ethnic Affairs Commission＆ Ministry of Education，School of Chemistry and Biotechnology，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650031，China)

The interaction between environmental hormone bisphenol A and bovine serum albumins was investigated by the means of electrochemical method.The results indicated that the oxidation peak currents of bisphenol A decreased when bovine serum albumins was added.Both proton and electron of electrochemical oxidation of bisphenol A at the electrode were 2.The combining ratio of bisphenol A to bovine serum albumins was 2∶1，with the combining constants of 5.81 ×1010.The proposed interactions is that BPA enters the hydrophobic water cavity of bovine serum albumins，causing the decrease of the dissociative concentration.

bisphenol A;bovine serum albumins;cyclic voltammetry;interaction

O 657.13

A

1672－8513(2011)02－0092－04

10.3969/j.issn.1672 －8513.2011.02.004

2010－12－02.

云南省社會發(fā)展科技計劃項(xiàng)目(2007B148M);民族藥資源化學(xué)國家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(MJY090101).

王辰(1982－)，女，碩士研究生.主要研究方向:分析化學(xué).

高云濤(1962－)，男，教授.主要研究方向:電分析化學(xué).