林志鑾，劉俊劭

(武夷學(xué)院環(huán)境與建筑工程系福建省高校綠色化工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建武夷山354300)

3，5－二硝基水楊酸法測定金錢草多糖的研究

林志鑾，劉俊劭

(武夷學(xué)院環(huán)境與建筑工程系福建省高校綠色化工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建武夷山354300)

用溶劑法對(duì)金錢草多糖進(jìn)行提取分離，研究并確定了用3，5－二硝基水楊酸(DNS)比色法測定金錢草多糖含量的方法，測定條件為:DNS最佳用量為2.0 mL，最佳顯色時(shí)間為5.0 min，最優(yōu)的溫度為沸水加熱.對(duì)金錢草多糖樣品平行測定6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.98%.樣品加標(biāo)回收率在92.52% ～104.49%之間，檢出限為0.022 mg/mL.

金錢草;3，5－二硝基水楊酸;多糖

金錢草為報(bào)春花科植物過路黃(Lysimachia christinae Hance)的新鮮或干燥全草，又名大金錢草、對(duì)座草、路邊黃、遍地黃等，被中國藥典2000年版所收載［1－2］.近年來有關(guān)金錢草的化學(xué)成分已有報(bào)道，主要含有酚類、黃酮類、甙類、鞣質(zhì)、揮發(fā)油等［3－4］，但目前針對(duì)金錢草多糖的分析研究還不多見.

天然多糖來源于動(dòng)物、植物及微生物，在海藻、真菌和高等植物中最為豐富.近年來對(duì)植物多糖的研究報(bào)道日趨增多，并發(fā)現(xiàn)很多多糖具有多種生物活性［5－6］.植物中糖類的測定主要采用分光光度法和色譜法進(jìn)行測定［7－8］.分光光度法因?yàn)橥度胭M(fèi)用低、操作簡單而容易普及，其中水楊酸法比苯酚－硫酸法［9－10］又具有毒性低、腐蝕性小、安全性好等特點(diǎn).文中利用溶劑法提取分離金錢草中多糖，研究了3，5－二硝基水楊酸法測定金錢草多糖含量的方法［11］.

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

紫外可見分光光度計(jì)UV－2550(日本島津)，真空干燥箱(上海精宏)，自動(dòng)純水蒸餾器(上海嘉鵬科技有限公司)，微型植物粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器廠).

DNS顯色試劑的配制:準(zhǔn)確稱取無水的3，5－二硝基水楊酸6.5 g，氫氧化鈉3.2 g溶解于40 mL蒸餾水中，加入15 mL丙三醇溶解定容至1 000 mL，貯存于棕色試劑瓶中［12］.

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:精確稱取在105℃ 烘干至恒重的葡萄糖0.100 0 g，定容到50 mL，即為2.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余藥品及試劑均為分析純.金錢草來自武夷山地區(qū)，經(jīng)武夷學(xué)院綠色化工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室賈劍暉實(shí)驗(yàn)師鑒定，自然曬干后，烘至恒重備用.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金錢草多糖的提取

金錢草全株→粉碎→石油醚回流2 h→乙醇回流2 h→蒸餾水煎1.5 h，重復(fù)3次合并水煎液濃縮到50 ml→乙醇沉淀→復(fù)溶→sevage法脫蛋白→乙醇沉淀→減壓過濾→丙酮溶劑洗滌→干燥→金錢草粗多糖.

1.2.2 多糖測定的方法

用3，5－二硝基水楊酸法測定金錢草多糖的含量.準(zhǔn)確移取葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)0.5 mL于25 mL比色管中，補(bǔ)充0.5 mL蒸餾水，再準(zhǔn)確加入2.0 mL的DNS溶液，沸水浴5 min，快速冷卻到室溫后，定容到25 mL.用紫外可見分光光度計(jì)在530 nm測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 影響因素的研究

2.1.1 最大吸收波長的確定

空白溶液調(diào)零后，對(duì)上述葡萄糖、總糖樣品進(jìn)行200～800 nm掃描，經(jīng)比較分析結(jié)果后，取干擾較少、測定穩(wěn)定且靈敏度較高的530 nm作為測定波長.

2.1.2 DNS用量的確定

準(zhǔn)確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL于25 mL比色管中，分別補(bǔ)水0.5 mL蒸餾水，再準(zhǔn)確加入1.2，1.6，2.0，2.4，2.8 mL 的 DNS溶液，沸水浴 5 min，快速冷卻到室溫后，定容到25 mL，測定.由圖1看出，DNS用量為2.0 mL時(shí)吸光度達(dá)到最大，為此選擇2.0mL為最佳DNS用量.

2.1.3 DNS顯色時(shí)間的確定

準(zhǔn)確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL于25 mL比色管中，分別補(bǔ)加0.5 mL蒸餾水，再準(zhǔn)確加入2.0 mL的 DNS 溶液，沸水浴1，2，3，4，5，6，7，8 min，快速冷卻到室溫后，定容到25 mL，測定.從圖2可知，顯色時(shí)間小于3 min時(shí)，反應(yīng)不完全，3～5 min內(nèi)吸光度緩慢上升，5 min后，吸光度基本無變化，為此，我們選用沸水浴5 min作為顯色時(shí)間.

2.1.4 比色反應(yīng)溫度對(duì)顯色的影響

按照1.2.2方法制備樣品，分別加熱至60，70，80，90，100℃，快速冷卻到室溫后，定容到25 mL后測定.由圖3中可以看出，吸光度隨著溫度的升高而升高，90℃以后吸光度增加的趨勢減小，為此選擇沸水浴為比色溫度.

2.1.5 工作曲線的確定

準(zhǔn)確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于25 mL比色管中，分別補(bǔ)充1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0.0 mL 蒸餾水，再準(zhǔn)確加入2.0 mL 的DNS溶液，沸水浴5 min，快速冷卻到室溫后，定容到25 mL，測定.工作曲線為:Y=2.167 7 X－0.000 8，r=0.996 9，結(jié)果表明該方法具有良好線性關(guān)系.

2.1.6 精密度、回收率的確定

準(zhǔn)確移取樣品0.5 mL多糖樣品溶液，按照1.2.2方法平行測定6次，RSD=3.98%.

精確移取0.5 mL金錢草樣品，再加入0.25 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.2.2方法測定，樣品加標(biāo)回收率(見表1)在92.52% ～104.49%之間.

表1 3，5－二硝基水楊酸法方法加標(biāo)回收率

2.1.7 方法檢出限的確定

對(duì)0.2，0.4，0.6 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行6次重復(fù)測定(結(jié)果見表2)，求出每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差S1，S2，S3，并對(duì)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差和濃度進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程.當(dāng)x=0時(shí)，求得S0=0.007 4，3倍的S0即為該方法的最小檢測限.

表2 3，5－二硝基水楊酸法方法檢出限

2.2 樣品測定

精確稱取提取的金錢草多糖樣品0.050 0 g，加水定容到10 mL容量瓶中.準(zhǔn)確移取該試液0.5 mL于25 mL比色管中，按照1.2.2方法制備樣品，平行測定3次(結(jié)果見表3).

表3 金錢草多糖提取物含量

3 結(jié)語

建立了用3，5－二硝基水楊酸(DNS)比色法測定金錢草多糖的方法，RSD為3.98%，樣品加標(biāo)回收率為95.52% ～104.49%.該方法顯色穩(wěn)定、操作簡單、低毒和安全性好等特點(diǎn).本實(shí)驗(yàn)方法簡便易行，實(shí)用有效，快捷.具有投入費(fèi)用低、操作簡單，容易普及、毒性低、腐蝕性小，安全性好等特點(diǎn).

［1］HEIJDIN R.Bioacyive carbphy draye palymers［J］.Carbohyclr EUR，1998(23):47－58.

［2］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:一部［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［3］劉雋，鄒國林.金錢草的研究進(jìn)展［J］.唐山師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，24(2):8－10.

［4］王斌貴，陳燕，張穎，等.過路黃在食用油脂中抗氧化作用的研究［J］.中國油脂，1991，16(5):32－35.

［5］馬紅櫻，張德，胡春香，等.植物活性多糖的研究進(jìn)展［J］.西北師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，40(3):112－117.

［6］喬英，董學(xué)暢，邱明華.靈芝多糖的研究概況［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2006，15(2):134－137.

［7］周斌，張承明.煙草中游離糖類的BSTFA衍生化與氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析方法研究［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，16(3):239－242.

［8］趙峰，阿芳，袁黎明，等.葡萄糖手性固定相的合成及對(duì)手性藥物對(duì)映體的拆分［J］.云南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，29(3):51－55.

［9］趙保發(fā)，張志信.金線蓮多糖提取工藝的研究［J］.云南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，28(4):60－64.

［10］何傳波，吳蘭蘭.鐵觀音茶多糖的酶法提取及脫蛋白工藝研究［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，18(1):41－44.

［11］周向軍，高義霞.3，5－二硝基水楊酸比色法測定薺菜多糖含量的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(35):171－173.

［12］王紅梅，鮑大鵬，楊立民.柱狀田頭菇胞內(nèi)外多糖的提取和測定［J］.安徽農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，14(3):18－20.

(責(zé)任編輯戴 云)

Determination of the Factors Affecting the Content of Polysaccharide in Lysimachia Christinae Hance by 3，5 －Dinitrosalicylic Acid Colorimeter

LIN Zhi-luan，LIU Jun-shao
(Key Laboratory for Green Chemical in Chemical Engineering and Technology Specialty of Fujian
Higher Education，Department of Civil Engineering and Architecture，Wuyi university，Wuyishan 354300，China)

The solvent extraction separation of Lysimachia christinae Hance′s polysaccharide was studied.The content of polysaccharide was determined by 3，5 －dinitrosalicylic acid(DNS)colorimeter.The DNS optimum dosage was 2.0 mg/mL，the best time for colorimeter was 5.0 min，and the optimal temperature was 100℃.The sixtime parallel determination proved to be RSD=3.98%，the recovery rate was between 92.52%—104.49%，and the detection limit of glucose was 0.022 mg/mL.

Lysimachia christinae Hance;3，5 －dinitrosalicylic acid;polysaccharide

O 629.12

A

1672－8513(2011)02－0089－03

10.3969/j.issn.1672－8513.2011.02.003

2010－09－29.

武夷學(xué)院科學(xué)研究基金(XQL05022).

林志鑾(1981－)，男，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師.主要研究方向:有機(jī)分析.