王高峰，彭德良，孫建華，黃文坤，彭煥，龍海波

1 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387

2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶新基因(Dd-cpl-1) 的克隆與序列分析

王高峰1,2，彭德良2，孫建華1，黃文坤2，彭煥2，龍海波2

1 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387

2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

L型半胱氨酸蛋白酶基因 (Cathepsin L-like cysteine proteinase gene) 為與植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)寄生能力相關(guān)的多功能基因。運(yùn)用RT-PCR和RACE的方法從馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)Ditylenchus destructor中克隆出1個(gè)L型半胱氨酸蛋白酶新基因 Dd-cpl-1 (GenBank登錄號(hào)為 GQ180107)。該基因 Dd-cpl-1 cDNA全長(zhǎng)序列含有 1個(gè) 1 131 bp的開(kāi)放性閱讀框(ORF)，編碼376個(gè)氨基酸殘基，其5′末端及3′末端分別含有29 bp和159 bp的非編碼區(qū) (UTR)。Dd-cpl-1內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，其基因組序列包含7個(gè)內(nèi)含子，且各內(nèi)含子兩端剪接位點(diǎn)序列遵守GT/AG規(guī)則。Dd-cpl-1基因推定的蛋白Dd-CPL-1與松材線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶高度同源，一致性達(dá)到77%。以不同物種中L 型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，推測(cè)推定的蛋白 Dd-CPL-1含有 L型半胱氨酸蛋白酶基因家族高度保守的催化三聯(lián)體(Cys183，His322和Asn343) 以及ERFNIN基系和 GNFD基系。半胱氨酸蛋白酶系統(tǒng)發(fā)育分析表明，Dd-cpl-1 屬于由 L型半胱氨酸蛋白酶組成的進(jìn)化分支。Dd-cpl-1的這些序列特征進(jìn)一步表明其為L(zhǎng)型半胱氨酸蛋白酶基因。這是首次在馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)中克隆到的L型半胱氨酸蛋白酶，為今后在蛋白水平對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的功能分析提供基礎(chǔ)。

馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)，L型半胱氨酸蛋白酶，Dd-cpl-1

Abstract:The Cathepsin L-like cysteine proteinase genes (cpls) are multifunction genes related to the parasitic abilities of plant parasitic nematodes. A new cathepsin L-like cysteine proteinase gene (Dd-cpl-1) (GenBank Accession GQ 180107) was cloned fromDitylenchus destructor by RT-PCR and RACE. The cDNA sequence consisted of a 1 131 bp open reading frame (ORF) encoding 376 amino acid residues that were franked by a 29 bp 5′-untranslated region (UTR) and a 159 bp 3′-UTR. Genomic sequence analysis showed that Dd-cpl-1 contained 7 introns, obeyed the GT/AG rule in the splice-site junctions. Homology analysis showed that the identity was 77% between Dd-cpl-1 deduced protein Dd-CPL-1 and cathepsin L-like cysteine proteinase of Bursaphelenchus xylophilus. Multi-sequence alignment indicated that there were the catalytic triad (Cys183, His322and Asn343) and two motifs ERFNIN motif and GNFD motif in deduced protein Dd-CPL-1. Cysteine proteinases phylogenetic analysis showed that Dd-cpl-1 belonged to the sub-clade of cathepsin L-like cysteine proteinases.

Keywords:Ditylenchus destructor, cathepsin L-like cysteine proteinase, Dd-cpl-1

由馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)Ditylenchus destructor 引起的甘薯莖線(xiàn)蟲(chóng)病是制約我國(guó)甘薯生產(chǎn)的三大病害之一，近年來(lái)已成為北方薯區(qū)最嚴(yán)重的病害。馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)Ditylenchus destructor Thorne，又稱(chēng)馬鈴薯莖線(xiàn)蟲(chóng)，是1945年作為一個(gè)單獨(dú)的種從鱗球莖莖線(xiàn)蟲(chóng) Ditylenchus dipsaci 中分離出來(lái)的，許多國(guó)家和地區(qū)都將其列為檢疫性有害生物[1-3]。2006年葛建軍等在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道從馬鈴薯上分離到馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)[4]。宛菲等對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)的21個(gè)馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)種群及1個(gè)韓國(guó)馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)種群的rDNA-ITS進(jìn)行測(cè)序研究，根據(jù)ITS擴(kuò)增片段大小將其分為A型和B型2類(lèi)群體[3]。依據(jù)D2/D3序列對(duì)上述 22個(gè)馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)不同種群進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明 A型和 B型種群形成 2個(gè)亞進(jìn)化分支，這說(shuō)明了馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)A型和B型群體在ITS區(qū)差異的實(shí)質(zhì)[5]。對(duì)馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)的分子生物學(xué)研究相對(duì)于其他植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)而言比較滯后，目前只從馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)中克隆出 3個(gè)乙酰膽堿酯酶基因 (Acetylcholinesterase gene)[6-8]和 2個(gè) β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶基因 (β-1,4-endoglucanase gene)[9]。

L型半胱氨酸蛋白酶 (Cathepsin L-like cysteine proteinase) 亞基因家族為半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase) 基因家族成員之一[10]。半胱氨酸蛋白酶為多種內(nèi)寄生生物的許多重要生理過(guò)程所必需，如蛻皮、角質(zhì)層重塑、胚胎發(fā)生、取食及免疫逃避[11]。Urwin等首次從植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)Heterodera glycines中克隆出1個(gè)L型半胱氨酸蛋白酶基因[12]。現(xiàn)已從植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)中克隆到多個(gè) L型半胱氨酸蛋白酶基因，如大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)(GenBank Accession No. CAA70693)、南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Meloidogyne incognita (GenBank Accession No.CAD89795)、馬鈴薯白線(xiàn)蟲(chóng) Globodera pallida(GenBank Accession No. AAY45896)、腎狀腎形線(xiàn)蟲(chóng)Rotylenchulus reniformis (GenBank Accession No.AAY45870) 和松材線(xiàn)蟲(chóng)Bursaphelenchus xylophilus(GenBank Accession No. ACH56225)。在秀麗小桿線(xiàn)蟲(chóng)Caenorhabditis elegans中發(fā)現(xiàn)，Ce-cpl-1為其早期胚胎發(fā)生所需[13-14]，參與秀麗小桿線(xiàn)蟲(chóng)卵黃蛋白修飾的調(diào)節(jié)過(guò)程[15]。人體寄生線(xiàn)蟲(chóng)馬來(lái)絲蟲(chóng) Brugia malayi成年雌蟲(chóng)中的Bm-cpl-1和Bm-cpl-5與秀麗小桿線(xiàn)蟲(chóng)中的L型半胱氨酸蛋白酶基因?yàn)椴煌N系但功能相同的基因 (Functional orthologs)[11]。在南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)中，對(duì)Mi-cpl-1進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其表達(dá)部位為南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)腸道細(xì)胞，推測(cè)Mi-cpl-1可能主要在南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)腸道中起消化作用[10]。Shingles等對(duì) Mi-cpl-1的實(shí)時(shí)表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mi-cpl-1在南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)水平較高，且 RNAi實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Mi-cpl-1與南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的寄生能力相關(guān)[16]。因此，植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶參與植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)侵染寄主植株的過(guò)程，但其具體生物學(xué)功能仍不確定。在本研究中，用簡(jiǎn)并引物FP和RP[17]從馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)中首次克隆出1個(gè)L型半胱氨酸蛋白酶基因，為今后在蛋白水平對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的功能分析提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 線(xiàn)蟲(chóng)材料

馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)為本實(shí)驗(yàn)室收集、培養(yǎng)和保存的實(shí)驗(yàn)種群。馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)方法為：在PDA培養(yǎng)基上接種半裸鐮刀菌 Fusarium semitectum，25 ℃培養(yǎng)4 d后，將馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)接種在半裸鐮刀菌上，馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)以半裸鐮刀菌為食，25 ℃條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖[8,18-19]。培養(yǎng)40~50 d后收集培養(yǎng)皿蓋上的線(xiàn)蟲(chóng)，用DEPC處理水多次洗滌后，將約100 μL的線(xiàn)蟲(chóng)加入到1.5 mL的DNase/RNase-free離心管中，并加入1 mL TRIzol，液氮速凍，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌感受態(tài)TOP010；普通DNA純化試劑盒 (天根生化科技有限公司)；EX Taq 酶 (TaKaRa公司)；TRIzol 試劑、Gene Race?Core Kit 及SuperScripeTMIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒 (Invitrogen 公司)，pGEM-T easy系統(tǒng)試劑盒 (Promega公司)。

1.2 馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)總RNA提取及cDNA第一鏈合成

采取凍融法用 TRIzol試劑提取馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)的總 RNA。按照 Gene Race?Core Kit及SuperScripeTMIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟合成 5′端及 3′端完整的cDNA第一鏈。

1.3 馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)的基因組DNA的提取

線(xiàn)蟲(chóng) DNA的提取參照彭德良的方法[20]，略有改動(dòng)。挑取 10頭馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)于含有 10 μL ddH2O 的0.2 mL Eppendorf管中，在液氮中速凍，用75%酒精消毒并用酒精燈烤干后自然冷卻的玻璃棒研磨至冰融化，反復(fù)3次，加入7 μL的WLB (Worm lysis buffer)，3 μL 蛋白酶 K 溶液 (600 μg/mL)，混勻，4 000 r/min離心5~10 s收集蟲(chóng)液于管底，–20 ℃冷凍30 min以上，然后轉(zhuǎn)入PCR儀，在65 ℃下溫育1.5 h，95 ℃反應(yīng)10 min，取出后12 000 r/min離心1 min，取上清，于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)cDNA片段的同源克隆

以簡(jiǎn)并引物FP和RP為引物 (表1)，以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s，48 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和分離，用普通DNA純化試劑盒純化后連接到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化 TOP010感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性單克隆搖菌，以FP、RP為PCR引物，用上述同樣的反應(yīng)條件進(jìn)行菌液檢測(cè)，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

表1 本研究所用的PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

1.5 3′ RACE

根據(jù)測(cè)序獲得的EST片段，用軟件Primer 5.0及DNAMAN設(shè)計(jì)基因特異引物CPF1、CPF2 (表1)，以cDNA第一鏈為模板，以3′ GeneRace Primer及CPF1為引物，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，70 ℃延伸 1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。再以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，以3′ GeneRace Nested Primer和 CPF2為 PCR引物，進(jìn)行 Nested PCR，PCR反應(yīng)條件與上述PCR反應(yīng)條件相同。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，純化目的片段，再進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆、PCR菌液檢測(cè)后測(cè)序。

1.6 5′ RACE

根據(jù)測(cè)序獲得的EST片段，用軟件Primer 5.0及 DNAMAN設(shè)計(jì)基因特異引物 CPR1、CPR2(表 1)。以 cDNA 第一鏈為模板，以 CPR1和 5′GeneRace Primer為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；再以PCR產(chǎn)物為模板，以CPR2和5′ GeneRace Nested Primer為引物，進(jìn)行 Nested PCR；PCR反應(yīng)條件與 3′RACE相同。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，純化目的片段，再進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆、PCR菌液檢測(cè)后測(cè)序。

1.7 cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增

依據(jù) cDNA拼接序列，用軟件 Primer 5.0及DNAMAN設(shè)計(jì)基因特異引物CPF3、CPR3 (表1)，對(duì)cDNA序列進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增。以cDNA第1鏈為模板，以CPF3、CPR3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，65 ℃延伸2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，純化目的片段，再進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆、PCR菌液檢測(cè)后測(cè)序。

1.8 基因組序列克隆

依據(jù)已獲得的目的基因cDNA序列，用Primer 5.0及 DNAMAN在兩端非編碼區(qū)及其附近設(shè)計(jì)基因特異引物CPF4、CPR4 (表1)。以馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)DNA為模板，以CPF4與CPR4為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的基因基因組序列。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，37個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，純化目的片段，再進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆、PCR菌液檢測(cè)后測(cè)序。

1.9 L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA序列及其編碼蛋白氨基酸序列分析

在 NCBI網(wǎng)站 (www.ncbi.nlm.nih.gov/) 進(jìn)行基因Blastx同源比對(duì)分析，用軟件DNAMAN對(duì)基因cDNA序列進(jìn)行開(kāi)放性閱讀框預(yù)測(cè)及其核苷酸序列翻譯，以軟件MEGA 4.0 UPGMA算法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。以Compute pI/Mw (http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html) 進(jìn)行蛋白分子量 (Mw) 預(yù)測(cè)。以 GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 進(jìn)行基因內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)分析。以 SingalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA全長(zhǎng)克隆與序列分析

用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化此擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果獲得1個(gè)498 bp的cDNA片段 (圖1)。經(jīng)Blastx分析發(fā)現(xiàn)該片段與松材線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶 (GenBank登錄號(hào)：ACH56255) 高度同源，一致性 (Identities) 達(dá)到83%，表明實(shí)驗(yàn)獲得的cDNA片段為目的基因L型半胱氨酸蛋白酶基因片段。依據(jù)馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)中該目的基因cDNA片段核苷酸序列設(shè)計(jì)基因特異引物，用RACE技術(shù)對(duì)目的基因3′和5′ cDNA末端序列進(jìn)行克隆，測(cè)序結(jié)果表明，其大小分別為383 bp和606 bp (圖2，圖3)。對(duì)已獲得的3個(gè)cDNA片段進(jìn)行序列拼接，結(jié)果獲得了1個(gè)全長(zhǎng)為1 319 bp的cDNA序列。在該cDNA序列兩端設(shè)計(jì)基因特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，結(jié)果得到了1個(gè)大小為966 bp的cDNA片段(圖4)。將此966 bp的cDNA片段和目的基因cDNA拼接序列進(jìn)行比對(duì)分析，分析結(jié)果顯示兩序列一致，這表明馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)中所獲得的L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA拼接序列正確。馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)中該L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA全長(zhǎng)含有1個(gè) 1 131 bp的開(kāi)放性閱讀框，其 5′端起始密碼子ATG前有1個(gè)大小為 29 bp的非編碼區(qū)，3′端有 1個(gè)159 bp的非編碼區(qū)，且3′端有多聚腺苷酸尾及加尾信號(hào) (AATAAA)。這表明馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)中該L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA序列為完整序列，并命名為Dd-cpl-1，其GenBank登錄號(hào)為GQ 180107。

圖1 CP簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增Fig. 1 Agarose gel (1.0%) showing the PCR product of degenerate primers FP & RP. M: DL2000 marker; 1: PCR product of degenerate primers FP & RP.

圖2 Dd-cpl-1基因3′ RACE擴(kuò)增Fig. 2 Agarose gel (1.0%) showing the PCR product of Dd-cpl-1 3′ RACE. M: DL2000 plus marker; 2: PCR product of Dd-cpl-1 3′ RACE.

圖3 Dd-cpl-1基因5′ RACE擴(kuò)增Fig. 3 Agarose gel (1.0%) showing the PCR product of Dd-cpl-1 5′ RACE. M: DL2000 marker; 3: PCR product of Dd-cpl-1 5′ RACE.

2.2 馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因基因組序列克隆及序列分析

根據(jù)已獲得的馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因 cDNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)基因特異引物CPF4和 CPR4，以馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng) DNA為模板擴(kuò)增目的基因的基因組序列并測(cè)序，結(jié)果獲得了 1個(gè)2 242 bp大小的DNA片段 (圖5)。依據(jù)馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA全長(zhǎng)序列及其基因組序列進(jìn)行內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng) L型半胱氨酸蛋白酶基因含有 7個(gè)內(nèi)含子，且內(nèi)含子兩端拼接位點(diǎn)序列遵守GT/AG規(guī)則 (圖 6)。

2.3 馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列分析

圖4 Dd-cpl-1基因cDNA全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增Fig. 4 Agarose gel (1.0%) showing the PCR product of CPF3& CPR3. M: DL2000 plus marker; 4: PCR product of CPF3 &CPR3.

圖5 馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因基因組序列PCR擴(kuò)增Fig. 5 Agarose gel (1.0%) showing the PCR product of CPF4& CPR4. M: DL2000 plus marker; 5: PCR product of CPF4 &CPR4.

根據(jù)馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA全長(zhǎng)序列推測(cè)其編碼蛋白含有376個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量約為42.4 kDa。以SingalP 3.0對(duì)馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示在其氨基端含有1個(gè)由20個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽。以來(lái)自不同物種的4種L型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，推測(cè)馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶含有保守的催化三聯(lián)體，分別為Cys183、His322和Asn343，且含有ERFNIN基系和GNFD基系 (圖7)。這表明，從馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)中所克隆到的基因Dd-cpl-1具有L型半胱氨酸蛋白酶基因家族所具有的序列特征[21-24]，進(jìn)一步證明其為L(zhǎng)型半胱氨酸蛋白酶基因。

圖6 馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig. 6 Intron-exon structure analysis result of cathepsin L-like cysteine proteinase from D. destructor.

圖7 馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)與其他物種中L型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列比對(duì)分析Fig. 7 Multi-sequence alignment of cathepsin L-like cysteine proteinases from D. destructor and other organisms. AAL16954,AAY45870, XP_002638172, Dd-CPL-1 is the CPL of Delia radicum, Rotylenchulus reniformis, Caenorhabditis briggsae and Ditylenchus destructor, respectively; Catalytic triad of Cys, His and Asn (*); Two conserved motifs of ERFNIN and GNFD (--).

2.4 不同類(lèi)型半胱氨酸蛋白酶系統(tǒng)進(jìn)化分析

馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶與不同物種中不同類(lèi)型的半胱氨酸蛋白酶系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)包含 4個(gè)進(jìn)化分支 (Subclade)，分別由B型、L型、S型及Z型半胱氨酸蛋白酶組成；其中，L型半胱氨酸蛋白酶進(jìn)化分支包含 2個(gè)支系，第 1個(gè)支系由植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)、人寄生線(xiàn)蟲(chóng)捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng) Haemonchus contortus和自由生線(xiàn)蟲(chóng)秀麗小桿線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶組成，另1個(gè)支系由非線(xiàn)蟲(chóng)動(dòng)物蓖子硬蜱 Ixodes ricinus、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、菜蛆Delia radicum與黃粉甲蟲(chóng)Tenebrio molitor L型半胱氨酸蛋白酶組成 (圖8)。這表明，馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶同松材線(xiàn)蟲(chóng)、秀麗小桿線(xiàn)蟲(chóng)、大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)、馬鈴薯白線(xiàn)蟲(chóng)、腎狀腎形線(xiàn)蟲(chóng)和南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶親緣關(guān)系較近。同源比對(duì)分析結(jié)果顯示，馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶與上述 7種線(xiàn)蟲(chóng) L型半胱氨酸蛋白酶一致性(Identities) 分別為77%、67%、66%、65%、64%、64%和 60%，這再一次表明馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)的Dd-cpl-1為L(zhǎng)型半胱氨酸蛋白酶基因。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Mi-cpl-1在南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)腸道細(xì)胞中表達(dá)[10]，并且在其整個(gè)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量很高，同時(shí)還與南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的寄生能力表現(xiàn)出相關(guān)性[16]。但至今仍未見(jiàn)關(guān)于植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶組織免疫定位分析的報(bào)道。馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，其氨基端有1個(gè)由20個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，這表明馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶為分泌型蛋白。馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶的組織免疫定位分析，將為闡明該酶在馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)侵染寄主過(guò)程中的具體生物學(xué)功能提供新的線(xiàn)索。

圖8 不同物種間半胱氨酸蛋白酶系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 8 Phylogenetic trees of cysteine proteinases from different species.: Cathepsin L-like cysteine proteinase (Ce-CPL-1) from free-living nematode C. elegans; : Cathepsin L-like cysteine proteinase (Hc-CPL-1) from human parasitic nematode Haemonchus contortus; : Cathepsin L-like cysteine proteinase cloned from D. destructor. The GenBank Accession No. and the species’ names of different cysteine proteinases are indicated in the ends of every branch.

人寄生線(xiàn)蟲(chóng)捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因Hc-cpl-1能夠?qū)π沱愋U線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因Ce-cpl-1缺失突變體進(jìn)行功能補(bǔ)償。因此推測(cè)動(dòng)物寄生線(xiàn)蟲(chóng)中的L型半胱氨酸蛋白酶基因與秀麗小桿線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因功能同源[25]，F(xiàn)ord等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)[11]。但目前仍未有證據(jù)表明植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因同動(dòng)物寄生線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因一樣，與秀麗小桿線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因功能同源。本研究中，以來(lái)自不同物種的B型、L型、S型和Z型半胱氨酸蛋白酶進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明，秀麗小桿線(xiàn)蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)與包括馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)在內(nèi)的5種植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶形成一個(gè)支系，獨(dú)立于由非線(xiàn)蟲(chóng)動(dòng)物中的 L型半胱氨酸蛋白酶所形成的另一個(gè)支系 (圖 8)。這表明，植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)中的L型半胱氨酸蛋白酶基因與秀麗小桿線(xiàn)蟲(chóng)及捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因Ce-cpl-1和Hc-cpl-1親緣關(guān)系較近。由此推測(cè)，植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因可能與動(dòng)物寄生線(xiàn)蟲(chóng)和秀麗小桿線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因?yàn)椴煌N系但功能相同的基因，其參與植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的早期胚胎發(fā)育等過(guò)程。馬鈴薯腐爛莖線(xiàn)蟲(chóng)L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA全長(zhǎng)與基因組序列的克隆及其相關(guān)序列特征分析為今后在蛋白水平闡明該基因的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)。

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Cloning and sequence analysis of a new cathepsin L-like cysteine proteinase gene from Ditylenchus destructor

Gaofeng Wang1,2, Deliang Peng2, Jianhua Sun1, Wenkun Huang2, Huan Peng2, and Haibo Long2
1 College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China
2 The State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China

Received: April 23, 2010; Accepted: June 12, 2010

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2010CB833603), National Natural Science Foundation of China (No.30872404).

Corresponding author: Jiye Cai. Tel/Fax: +86-20-85223569; E-mail: tjycai@jnu.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2010CB833603)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30872404) 資助。