陳紅，鄧瑤，譚文杰，王文，管潔，文波，殷霄，阮力

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 病毒病應(yīng)急技術(shù)中心，北京 100052

含乙型肝炎病毒S-PreS1基因的DNA疫苗與蛋白顆粒疫苗聯(lián)合免疫可增強(qiáng)免疫應(yīng)答

陳紅*，鄧瑤*，譚文杰，王文，管潔，文波，殷霄，阮力

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 病毒病應(yīng)急技術(shù)中心，北京 100052

為研制新型有效的HBV治療性疫苗，構(gòu)建了含PreS1與S融合基因的HBV DNA疫苗，即pVRC-HBSS1 (PreS1 21–47 aa融合在S抗原1–223 aa的羧基端)，并制備了CHO表達(dá)相同結(jié)構(gòu)的蛋白顆粒亞單位疫苗HBSS1。在Balb/C小鼠中采用不同的DNA免疫方式 (即肌肉注射、皮內(nèi)注射加電轉(zhuǎn)) 初免3次，蛋白顆粒亞單位疫苗 (不同佐劑) 肌肉注射加強(qiáng)免疫 1次，然后我們分析比較了各組疫苗所引起的免疫應(yīng)答特點(diǎn)?？贵w檢測(cè)結(jié)果表明：皮內(nèi)注射結(jié)合電轉(zhuǎn)初免組產(chǎn)生的PreS1與S特異性抗體水平皆高于肌肉直接注射組。進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)DNA疫苗與蛋白顆粒亞單位疫苗兩種疫苗聯(lián)合應(yīng)用后S抗原特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答 (IFN-γ ELISpot分析) 明顯高于DNA疫苗或蛋白顆粒亞單位單獨(dú)應(yīng)用，其中皮內(nèi)注射+電轉(zhuǎn)結(jié)合蛋白顆粒亞單位疫苗聯(lián)合免疫組可產(chǎn)生最強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。這些研究為新型HBV治療性疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì)與合理應(yīng)用提供了依據(jù)。

乙型肝炎病毒 (HBV)，DNA疫苗，顆粒亞單位疫苗，電轉(zhuǎn)，聯(lián)合免疫

Abstract:To develop novel and effective HBV therapeutic vaccine, we constructed an expression vector, pVRC-HBSS1, in which PreS1 (21?47aa) coding gene fused to the C-terminal of the S (1?223 aa) coding gene of HBV, and prepared the protein particle vaccine HBSS1 that consist of S and PreS1 fusion antigen derived from CHO system. We immunized mice by priming three times with DNA vaccine via different methods (i.e., intramuscular injection, intradermal injection with electroporation), then boosting oncewith protein particle vaccine. We analyzed the immune response among various vaccination groups. The higher level of S or PreS1 specific antibodies was detected in the group via intradermal injection with electroporation, compared with that of direct intramuscular injection. We further found that the specific cellular immune responses (IFN-γ ELISpot analysis) in the group priming with DNA vaccines and boosting with protein subunit vaccine particles, was significantly higher than that of the DNA or protein particle subunit alone. Moreover, combination vaccination priming with intradermal injection DNA via electroporation and boosting with protein particle induced the strongest cellular immune response. These results provide a basis for rational design and application of the novel HBV therapeutic vaccine.

Keywords:Hepatitis B virus (HBV), DNA vaccine, subunit particle vaccine, electroporation, prime boost vaccination

乙型肝炎病毒 (HBV) 不僅可引起急慢性肝炎，而且與肝硬化、肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，盡管乙肝疫苗的使用已逾20年，目前HBV仍是傳播最為廣泛的病原之一[1]。HBV疫苗在中國(guó)已納入計(jì)劃免疫，使用最為廣泛的為酵母或CHO表達(dá)含S全長(zhǎng)的顆粒亞單位疫苗[2]。盡管 HBV疫苗的應(yīng)用已達(dá) 20余年并取得極大成功，但仍有5%~10%的人群不能產(chǎn)生保護(hù)性anti-HBS抗體，且近年來(lái)，S變異流行株呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[2]。目前全球絕大多數(shù)慢性HBV感染者得不到有效治療，而長(zhǎng)期持續(xù)性感染將可能最終導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭或者肝癌，當(dāng)前臨床上乙肝主要藥物的治療效果有限，且長(zhǎng)期應(yīng)用中存在不良反應(yīng)，仍需開(kāi)發(fā)新的治療策略，因而HBV治療性疫苗的研發(fā)與應(yīng)用成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

HBV的治療性疫苗主要包括重組蛋白疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗等[2]，DNA疫苗與蛋白疫苗相比，除了可激發(fā)特異性抗體應(yīng)答外，還可產(chǎn)生較強(qiáng)的、持久的T輔助 (Th) 細(xì)胞應(yīng)答與抗原特異的CTL反應(yīng)。此外，DNA疫苗還具備制備簡(jiǎn)單、低廉并易于多價(jià)使用等優(yōu)點(diǎn)[3]，多種DNA疫苗應(yīng)用的結(jié)果表明其主要的問(wèn)題是其免疫原性相對(duì)較弱 (尤其是在大動(dòng)物與人中)，故近年來(lái)科學(xué)家們探索了采用多種途徑增強(qiáng)其免疫原性[3]，如抗原改造、與蛋白疫苗或載體疫苗聯(lián)合應(yīng)用、采用基因槍及體內(nèi)電轉(zhuǎn)等方式免疫等。

本研究在前期工作基礎(chǔ)上[4-5]首先構(gòu)建了含PreS1與S融合抗原的HBV DNA疫苗[6]，即pVRCHBSS1 (PreS1與S融合)，分別采用肌肉注射、皮內(nèi)注射+電轉(zhuǎn)兩種方式初免后，用蛋白顆粒亞單位疫苗(不同佐劑) 肌肉注射加強(qiáng)免疫1次，在小鼠中比較分析了體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 HBV顆粒蛋白疫苗與佐劑

CHO表達(dá)的含 S+PreS1融合抗原的顆粒疫苗(HBSS1) 的制備及表達(dá)鑒定 (SDS聚丙烯胺凝膠電泳及電鏡觀察) 參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。Al(OH)3佐劑為北京華爾盾科技服務(wù)公司提供，濃度為2 mg/mL；CpG-ODN 1826[4-6]由NEB 公司合成，由上述抗原與佐劑分別配伍成2種免疫制劑，即HBSS1+Al(OH)3、HBSS1+CpG，其中每劑中抗原含量皆為 2 μg，Al(OH)3含量為 1 mg/mL，CpG 含量為 10 μg。

1.2 HBV DNA疫苗的構(gòu)建與表達(dá)鑒定

包含 HBV S抗原 (S:1–223 aa) 與前 S1抗原(PreS1：21–47 aa) 融合基因的pcHBSS表達(dá)質(zhì)粒為本室保存[9]，可用于在 CHO細(xì)胞中表達(dá)制備 HBV顆粒樣蛋白疫苗。乙肝病毒顆粒樣 DNA疫苗質(zhì)粒pVRC-HBSS1的構(gòu)建參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]，即將HBV S抗原 (S:1–223 aa) 與前 S1 抗原 (PreS1：21–47 aa) 融合基因的目的片段，連接到pVRC8301載體上，限制酶分析和測(cè)序篩選獲得HBV DNA疫苗陽(yáng)性質(zhì)粒pVRC-HBSS1。DNA疫苗質(zhì)粒用 Endofree試劑盒(德國(guó) Qiagen) 純化。純化的 pVRC-HBSS1質(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后裂解293T細(xì)胞，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blotting分析，用抗PreS1小鼠單抗作為一抗檢測(cè)靶抗原表達(dá) (圖1)。

圖1 乙肝病毒新型DNA疫苗的表達(dá)檢測(cè)及顆粒亞單位蛋白疫苗的鑒定Fig. 1 Expression detection of HBV DNA vaccine containing PreS1 and S fusion gene. (A) Western blotting analysis of expression of SS1 antigen in the HBV DNA vaccine. (B)Characterization of HBV particle subunit vaccine which consist of SS1 antigen by SDS-PAGE staining. (C) Electronmicrograph of HBV particle subunit vaccine which consist of SS1 antigen. M: protein marker; SS1: S+PreS1 fusion antigen;S: S antigen.

1.3 動(dòng)物分組與免疫方案

Balb/C小鼠，雌性，6~8周齡，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)繁殖中心，按照免疫方式隨機(jī)分為4組 (表1)，A、B與C每組12只，另設(shè)生理鹽水對(duì)照組 (6只)，注射方式和免疫劑量見(jiàn)表1。DNA 疫苗初免 (0、3、6周)，A組和 B組為肌肉注射，C組為皮內(nèi)注射，結(jié)合卡鉗式電轉(zhuǎn)免疫 (表1)[7-8]，采用BTX ECM830電穿孔儀，卡鉗式電極皮內(nèi)免疫 (C組) 的電轉(zhuǎn)參數(shù)為：100 V，10 ms間隔，3次脈沖；然后電極反向，75 V，15 ms，3次脈沖，間隔1 s/次。蛋白加強(qiáng) (第 10周) 為肌肉注射免疫。A、B與 C每組分別于第10周與第14周各取6只采血與脾細(xì)胞進(jìn)行抗體檢測(cè)與細(xì)胞免疫應(yīng)答分析。

1.4 體液免疫應(yīng)答檢測(cè)

眼眶采血檢測(cè)抗體，倍比稀釋后，參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行[5-6]。每組血清混合后皆從1∶10起倍比稀釋。

1.5 IFN-γ ELISpot檢測(cè)

HBV S抗原合成肽庫(kù)參見(jiàn)文獻(xiàn)[5]，分別與小鼠脾細(xì)胞 (5×105) 孵育，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行[5-6]。反應(yīng)終止后在ELISpot 讀數(shù)儀上計(jì)數(shù)分析，以106脾細(xì)胞中斑點(diǎn) (減去無(wú)關(guān)肽孔) 計(jì)數(shù)求均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS14.0軟件處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用One-way ANOVA 檢驗(yàn)法。

表1 動(dòng)物分組及免疫方案Table 1 Group and immunization of mice used in this study

2 結(jié)果

2.1 DNA疫苗的表達(dá)及顆粒亞單位蛋白疫苗的檢定

本實(shí)驗(yàn)以前的研究表明[4]，將 HBV PreS1區(qū)21-47位氨基酸融合到截短型S抗原 (1?223 aa) 的羧基端，可在CHO系統(tǒng)中表達(dá)形成穩(wěn)定的VLP結(jié)構(gòu)抗原，為此本研究中將上述含 PreS1的融合抗原克隆到DNA疫苗載體pVRC上形成DNA侯選疫苗，即 pVRC-HBSS1，體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞后進(jìn)行Western blotting分析證實(shí)融合抗原的有效表達(dá) (圖1A)。因糖基化不同，SS1出現(xiàn)大小約為24、27 kDa兩條帶。顆粒亞單位蛋白疫苗的SDS-PAGE電泳及顆粒的電鏡鑒定參見(jiàn)文獻(xiàn)[4] (圖1B，1C)。Western blotting與SDS-PAGE染色實(shí)驗(yàn)中采用僅含S主蛋白的DNA疫苗或顆粒亞單位蛋白作對(duì)照。這些結(jié)果均與前述文獻(xiàn)報(bào)道相符。

2.2 DNA疫苗初免顆粒樣蛋白疫苗加強(qiáng)后小鼠的抗體應(yīng)答及IgG亞型

DNA疫苗初免后4周，肌肉注射組抗PreS1及抗S抗體平均滴度分別為60與10，而皮內(nèi)注射結(jié)合電轉(zhuǎn)組則分別為200與1 000；蛋白疫苗加強(qiáng)免疫后4周采血進(jìn)行特異性抗體滴度的測(cè)定，結(jié)果表明(表2)：與初免后4周測(cè)定結(jié)果相比，抗體平均滴度各組皆有所提高，其中抗PreS1抗體以A組 (肌肉注射 DNA疫苗初免，蛋白疫苗結(jié)合 Al(OH)3佐劑加強(qiáng)免疫) 抗體平均滴度最高，而抗S抗體以C組(DNA疫苗皮內(nèi)注射+電轉(zhuǎn)初免，蛋白疫苗結(jié)合Al(OH)3佐劑加強(qiáng)免疫) 平均滴度較高，蛋白疫苗結(jié)合CpG 佐劑加強(qiáng)免疫組 (B組) S與PreS1抗體平均滴度皆低于蛋白疫苗結(jié)合Al(OH)3佐劑加強(qiáng)免疫組 (A和C組)。除了對(duì)抗體滴度進(jìn)行分析外，我們也在末次免疫后第4周采血以1∶100稀釋后對(duì)各組誘導(dǎo)的IgG亞型進(jìn)行分析 (表2)，結(jié)果表明：DNA疫苗肌肉注射或皮內(nèi)注射結(jié)合電轉(zhuǎn)初免，含鋁佐劑的蛋白制劑加強(qiáng)后 (A和 C組) 產(chǎn)生的針對(duì) S與PreS1的抗體 IgG亞型各組 IgG2a /IgG1＞1；而含CpG佐劑的蛋白制劑加強(qiáng)后 (B 組) 抗 PreS1抗體以IgG2a為主，而針對(duì)S的抗體IgG亞型，則IgG1略高于IgG2a。

表2 聯(lián)合免疫后抗原特異的總抗體平均滴度與亞型Table 2 Total antibody titers and subtype class in sera of mice after prime-boost vaccination

2.3 DNA疫苗初免顆粒樣蛋白疫苗加強(qiáng)后小鼠的抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答明顯增強(qiáng)

作為治療性DNA疫苗，細(xì)胞免疫應(yīng)答是評(píng)定有效性最關(guān)鍵的評(píng)價(jià)指標(biāo)，為此我們采用 IFN-γ ELISpot方法檢測(cè)了DNA疫苗初免后4周及 DNA疫苗與蛋白疫苗聯(lián)合免疫后 4周各組小鼠脾細(xì)胞中抗原特異的IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如圖2所示。DNA疫苗初免蛋白疫苗加強(qiáng)應(yīng)用后 S特異的 SFC讀數(shù)明顯提高，SFC讀數(shù)均值＞400 SFC/106脾細(xì)胞，顯著高于DNA疫苗肌肉注射初免各組。而且以DNA疫苗皮內(nèi)電轉(zhuǎn)初免 (10 μg)，結(jié)合蛋白制劑加強(qiáng)應(yīng)用后增強(qiáng)效果最明顯 (SFC讀數(shù)均值＞800 SFC/106脾細(xì)胞)。

圖2 ELISPOT分析不同HBV疫苗免疫后小鼠脾細(xì)胞中IFN-γ分泌斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù) (SFCs)Fig. 2 ELISPOT analysis for IFN-γ secretion in mouse splenocytes immunized with different HBV vaccines as indicated. Data represent the average of spot forming cells(SFCs) per million of splenocytes from 6 mice/group. * P<0.05;** P<0.01.

3 討論

誘導(dǎo)針對(duì)多個(gè)抗原的較強(qiáng)的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答是研制新型 HBV治療性疫苗的目標(biāo)[2,11-12]。HBV 表面抗原 (HBS) 在 CHO細(xì)胞或酵母中表達(dá)可自我裝配成22 nm球形VLP，是市售HBV疫苗的有效保護(hù)性抗原[2]。PreS1含多個(gè)比S蛋白免疫原性更強(qiáng)的 T細(xì)胞和 B細(xì)胞表位[9-10]，并含肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn) (21?47 aa)，對(duì)于病毒的附著與進(jìn)入等有重要作用[13]，故對(duì)PreS1抗原的免疫反應(yīng)在中和和阻斷HBV感染及清除HBV感染上起著重要作用[9-12]。

前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[4]：在 CHO細(xì)胞中表達(dá)HBSS1 即 S (1?223 aa)+PreS1 (21?47 aa) 亦可形成穩(wěn)定分泌的病毒樣顆粒，PreS1與S抗原的摩爾比率為1∶1。這種病毒顆粒樣蛋白抗原皆可在動(dòng)物模型中快速激發(fā)有效的體液免疫應(yīng)答[4-5]。而 DNA疫苗制備快速、低廉，而且較蛋白疫苗更易激發(fā)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但目前DNA疫苗面臨的主要挑戰(zhàn)是免疫強(qiáng)度有待增強(qiáng)[3,11]。最近大量文獻(xiàn)報(bào)道[3,7-8,11]通過(guò)體內(nèi)電轉(zhuǎn)可明顯增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)外源 DNA的攝取與表達(dá)水平，外源蛋白引起局部的炎性因子聚集從而可同時(shí)提高DNA疫苗所誘導(dǎo)的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，而DNA疫苗與蛋白疫苗或載體疫苗聯(lián)合應(yīng)用則是增強(qiáng) DNA疫苗免疫應(yīng)答最有效的策略之一[3]。

本研究旨在研制可誘導(dǎo)多抗原特異細(xì)胞免疫應(yīng)答的HBV治療性疫苗，故首先采用DNA疫苗載體構(gòu)建了包含上述顆粒樣結(jié)構(gòu)的 DNA疫苗，即pVRC-HBSS1，為增強(qiáng)免疫原性，結(jié)合應(yīng)用電轉(zhuǎn)方式進(jìn)行初免；同時(shí)為進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答水平，采用了與蛋白顆粒亞單位疫苗聯(lián)合應(yīng)用的免疫策略，在小鼠中分析比較其免疫應(yīng)答特點(diǎn)。

我們的前期研究采用 2次蛋白疫苗 (含不同佐劑) 肌肉注射初免，1次DNA疫苗皮內(nèi)電轉(zhuǎn)免疫加強(qiáng)的聯(lián)合免疫方式，在小鼠中分析比較了各疫苗所引起的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答。結(jié)果表明[6]：HBSS1 DNA疫苗結(jié)合皮內(nèi)注射+電轉(zhuǎn)方式可明顯加強(qiáng)含S-PreS1顆粒的蛋白疫苗在小鼠中免疫效果，其特異性抗體滴度皆高于104，高于本研究中采用的聯(lián)合免疫所誘導(dǎo)的抗體水平，但細(xì)胞免疫強(qiáng)度卻明顯低于本研究中采用的聯(lián)合免疫，前者小鼠中 IFN-γ分泌斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)均值皆低于250 SFC/106脾細(xì)胞，而本研究中聯(lián)合免疫后SFCs讀值均高于400 SFC/106脾細(xì)胞，最高均值達(dá)800 SFC/106脾細(xì)胞。故本研究中所采用的聯(lián)合免疫方案更適合 HBV治療性疫苗的要求。

總之，本研究中HBSS1 DNA疫苗初免蛋白疫苗加強(qiáng)的聯(lián)合免疫策略，結(jié)合皮內(nèi)電轉(zhuǎn)方式可產(chǎn)生最強(qiáng)的抗原特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答，是研發(fā)新型有效HBV治療性疫苗的侯選制劑與免疫方案，值得進(jìn)一步在大動(dòng)物或人群中評(píng)價(jià)與應(yīng)用。

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Boosting with HBV subunit particle vaccine enhance immune response of novel DNA vaccine consisting of S-PreS1 fusion gene in mice

Hong Chen*, Yao Deng*, Wenjie Tan, Wen Wang, Jie Guan, Bo Wen, Xiao Yin, and Li Ruan
Biotech Center for Viral Diseases Emergency, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China

Received: April 7, 2010; Accepted: June 7, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 30770146, 30770149), National Basic Research Program of China (973 Program)(No. 2009CB119104).

Corresponding author: Qingyin Zeng. Tel: +86-10-62836440; E-mail: qingyin.zeng@ibcas.ac.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 30770146, 30770149)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2009CB119104) 資助。