于蕊，侯利華，劉樹玲，于長明，張曉艷，劉穎，陳薇

軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

構(gòu)象穩(wěn)定的破傷風毒素Hc片段突變體 (HcM) 的制備及其免疫原性分析

于蕊，侯利華，劉樹玲，于長明，張曉艷，劉穎，陳薇

軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

破傷風是由破傷風桿菌侵入人體傷口、生長繁殖、產(chǎn)生毒素而引起的一種急性特異性感染，其死亡率高，嚴重危害人民生命健康。研究證實破傷風毒素重鏈 C端 (Hc) 具有與毒素受體結(jié)合的活性，完全保留了全分子的免疫原性，有望開發(fā)成為新的基因工程破傷風亞單位疫苗以替換傳統(tǒng)的甲醛滅活類毒素疫苗。由于野生型Hc蛋白 (HcW) 易形成分子間及分子內(nèi)二硫鍵，且各構(gòu)象分子之間易發(fā)生不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)換，為疫苗的生產(chǎn)工藝帶來困難，因此，通過將破傷風HcW蛋白的869位半胱氨酸突變?yōu)楸彼?，?gòu)建構(gòu)象穩(wěn)定的破傷風亞單位疫苗突變體HcM，對HcM進行表達、發(fā)酵和純化，研究其在不同條件下的穩(wěn)定性，比較其與受體GT1b親和力的變化及免疫原性。實驗結(jié)果表明HcM在大腸桿菌中獲得了高效可溶性表達，通過QXL柱、phenyl-Hs柱和source30Q柱三步純化，可獲得純度95%以上的HcM蛋白。純化后的HcM蛋白在不同保存條件下構(gòu)象穩(wěn)定且保持了與破傷風毒素受體GT1b結(jié)合的活性。免疫小鼠后，HcM能夠誘導小鼠產(chǎn)生高滴度抗體并能夠保護小鼠抵御1×103LD50劑量的破傷風毒素攻擊。以上結(jié)果表明構(gòu)象穩(wěn)定的HcM有望成為新的破傷風重組亞單位疫苗候選者，其生產(chǎn)工藝簡單、穩(wěn)定且保持了與野生型相似的免疫原性，不論是針對日常破傷風治療還是對于國家應對突發(fā)事件 (戰(zhàn)爭、地震等災害) 的藥品儲備均具有重大意義。

破傷風，HcM，構(gòu)象穩(wěn)定，亞單位疫苗

Abstract:Tetanus is caused by tetanus toxin synthesized by Clostridium tetani. Fragment C (Hc), the 50 kDa carboxy-terminal portion of tetanus toxin, is nontoxic but has receptor protein binding activities, which has been evaluated as a potential new recombinant subunit vaccine to replace the traditional formaldehyde inactivated toxoid vaccine. It is easy for wild Hc (HcW) to form inter- and intra-molecular disulfide bonds and the different conformations changes unstably, which brings difficulties for vaccine production technology. In our study, the Cys 869 of HcW was mutated to Ala and the conformation-stable fragment-C mutant of tetanus toxin (HcM) was constructed. The HcM was expressed, fermented and purified and its stability, receptor binding andimmunogenicity were evaluated. The result showed that the HcM got high-level expression and was purified to >95% of purity. The purified HcM was conformation-stable at different temperature for different time and kept the binding activities with one of its receptor GT1b. Mice given three vaccinations by HcM developed a protective immune response and were 100% protected against an intraperitoneal administration of 1×10350% lethal doses (LD50s) of tetanus neurotoxin. All the results showed that the conformation-stable HcM had potent immunogenicity as a recombinant tetanus vaccine candidate with simple production process and similar immunogenicity with HcW. Whether for routine tetanus therapy or for countries to respond to unexpected events (war,earthquake or other disaster), it is of great significance.

Keywords:tetanus, HcM, conformation-stable, sub-unit vaccine

破傷風是一種嚴重危害人類生命健康的疾病，它是由革蘭氏陽性、厭氧的梭狀芽胞桿菌——破傷風桿菌侵入人體傷口、生長繁殖、產(chǎn)生破傷風毒素引起的一種急性特異性感染，破傷風毒素入侵神經(jīng)系統(tǒng)可導致人全身性肌肉痙攣，進而全身性衰竭或窒息死亡。一切開放性損傷，均有發(fā)生破傷風的可能[1]。破傷風毒素的毒性非常強烈，僅次于肉毒毒素[2]，約100 ng的破傷風毒素便可以致人死亡。破傷風在廣大貧困落后的第三世界國家和地區(qū)非常嚴重。據(jù)估計，世界上每年約有100萬病例發(fā)生，死亡率在50%左右。在發(fā)展中國家，新生兒破傷風死亡率高達90%。因此各國均致力于尋找高效、安全的破傷風預防藥物[3]。

破傷風毒素全長1 315個氨基酸，分子量為150 kDa，共由A、B、C三部分組成，每部分分子量均為50 kDa。C片段是重鏈的C 端，具有結(jié)合神經(jīng)細胞的作用[4]。B片段是重鏈的 N端，具有導入作用[5]。A片段是輕鏈，有蛋白酶活性，可抑制神經(jīng)傳遞物質(zhì)的釋放，具有麻痹作用[6]。傳統(tǒng)的類毒素疫苗是破傷風毒素經(jīng)甲醛脫毒、鋁佐劑吸附精制而成的，雖然其免疫效果較好，但仍存在一些問題：接種類毒素后有一定的副反應發(fā)生；破傷風梭菌可形成芽胞形式，毒性高，生產(chǎn)疫苗有一定危險性；甲醛處理類毒素容易造成污染；化學處理后的類毒素可能發(fā)生毒性逆轉(zhuǎn)；而且重要的是免疫期短，隨著年齡的增長，對破傷風免疫力下降，兒童需要4~6年加強免疫，成人需要每10年加強一次免疫。因此，現(xiàn)有的類毒素疫苗還需進一步改進和發(fā)展，而開發(fā)新型的基因工程疫苗是方向之一。實驗已證實用完整的毒素分子進行免疫并不是必需的[7]。破傷風天然C 片段 (HcW) 保留了完整毒素與神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合等許多性質(zhì)[8]，免疫效價與毒素相當，無毒性，過敏原性低，是將來發(fā)展亞單位疫苗和基因工程疫苗的候選者[9-10]，已被用于研究亞單位疫苗、細菌和病毒載體疫苗、粘膜疫苗等很多方面[11]。

野生型HcW分子內(nèi)含有4個半胱氨酸，極易形成分子間及分子內(nèi)二硫鍵，導致不同形式的單體及多聚體出現(xiàn)，且這種不同構(gòu)象形式可隨著蛋白濃度、環(huán)境溫度及緩沖液條件的不同而發(fā)生相互轉(zhuǎn)換[12]，這在疫苗的生產(chǎn)工藝上造成了一定的困難。為了解決這個問題，我們將HcW分子中的一個關(guān)鍵半胱氨酸進行了突變，構(gòu)建了 Hc突變體HcM，該突變體為構(gòu)象穩(wěn)定的單體，簡化了整個疫苗的生產(chǎn)工藝并能夠保證各批次疫苗之間的穩(wěn)定性。我們對改造后的HcM進行了表達、發(fā)酵和純化，并研究了其與受體的結(jié)合活性、穩(wěn)定性、免疫原性等，探討其作為人用破傷風疫苗的可行性，為制備構(gòu)象穩(wěn)定的破傷風亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

通過以上研究，我們希望能夠通過研究制備構(gòu)象穩(wěn)定的破傷風亞單位疫苗，為破傷風的預防提供一條更加安全、有效、簡便的道路，其最終目的是希望能夠替代目前使用的存在很多毒副作用及生產(chǎn)繁瑣生產(chǎn)成本高的類毒素疫苗，這對日常破傷風治療和國家應對突發(fā)事件 (戰(zhàn)爭、地震等災害) 的藥品儲備均具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

Q Sepharose XL柱、Phenyl-HS柱和source30Q柱購自通用電氣 (中國) 醫(yī)療集團。DNA 核酸內(nèi)切酶 EcoRⅠ、XhoⅠ和 T4 DNA連接酶購自寶生物工程 (大連) 有限公司。Isopropylthio-D-galactoside(IPTG) 和神經(jīng)節(jié)苷酯GT1b購自Sigma。Al(OH)3佐劑購自 Brenntag Biosector (丹麥)公司。表達載體pET-32a(+) 和其宿主菌 E. coli BL21 (DE3) 購自Novagen。野生型HcW基因片段為本實驗室全合成后保存。HcW蛋白為本實驗室表達純化后保存。小鼠抗破傷風類毒素多抗血清為本實驗室制備保存。HRP標記的羊抗鼠 IgG購自中杉金橋北京有限公司。BALB/c小鼠購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。破傷風毒素和甲醛滅活的破傷風類毒素均為國家藥品生物制品檢定所贈送。

1.2 方法

1.2.1 HcM的原核可溶性高表達

選用本實驗室之前全合成的 HcW (865-1351)基因片段為模板，上游引物aaaaacttgatgcatgggtcgacaacgaagaag-3′ (下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點) 和下游引物 MR：5′-ccgctcgag tcattagtcgttggtccaaccttcatc-3′ (下劃線部分為 XhoⅠ酶切位點)，采用probest DNA聚合酶，致突變PCR擴增將原 HcW片段中的 Cys869 (tgt) 突變?yōu)锳la869(gca)，從而獲得完整的HcM DNA片段。HcM片段回收、酶切后連接入 EcoRⅠ和 XhoⅠ雙酶切后的pET32a(+) 載體中，轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆送測序。將測序正確的HcM表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，挑取單克隆至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至 OD600≈0.6時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，28 ℃、220 r/min繼續(xù)誘導表達4 h。離心收獲菌體沉淀，PBS重懸后超聲碎菌，離心取上清，進行 12% SDS-PAGE蛋白電泳以檢測目的蛋白的表達。

1.2.2 無標簽HcM的發(fā)酵及純化

表達HcM蛋白的種子液1 L，轉(zhuǎn)接入30 L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至OD600≈0.6時，加入終濃度為0.2 mmol/L的 IPTG，28 ℃、300 r/min繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。10 000×g、4 ℃離心收集菌體，用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.5) 重懸后勻漿碎菌。20 000×g、4 ℃離心收集上清。上清液過Q Sepharose XL柱進行陰離子交換，用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 8.5) 平衡后，用含0~0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫。含有目的蛋白的洗脫液加入終濃度為0.8 mol/L的 (NH4)2SO4后，過苯基疏水phenyl-HS柱進行下一步純化。目的蛋白用含濃度0.8~0 mol/L的 (NH4)2SO4的 Tris-HCl (pH 8.5) 緩沖液進行梯度洗脫。含有目的蛋白的洗脫液用脫鹽柱置換緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5) 后，過source30Q柱進行進一步的陰離子交換，目的蛋白用含0~0.5 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 8.5) 進行梯度洗脫，收集產(chǎn)物用SDS-PAGE蛋白電泳確定蛋白純度。

1.2.3 HcM和HcW構(gòu)象穩(wěn)定性比較

將純化后的HcM及HcW蛋白分別于4 ℃、?20 ℃、?80 ℃保存0 d、2 d、7 d和2個月，采用非還原SDS-PAGE檢測蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性。

1.2.4 HcM和HcW與神經(jīng)節(jié)苷酯GT1b的結(jié)合

神經(jīng)節(jié)苷酯 GT1b用甲醇稀釋至 5 μg/mL，100 μL/孔包被96孔酶聯(lián)板，室溫放置過夜至甲醇完全揮發(fā)，PBST洗滌5 min，重復4次。將HcM和HcW分別用PBST從20 μg/mL進行倍比稀釋，100 μL/孔加入96孔板中，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌5 min，重復4次后加入1∶800稀釋的小鼠抗破傷風類毒素多抗血清，100 μL/孔，37 ℃繼續(xù)孵育1 h。PBST洗滌5 min，重復4次后加入1∶4 000稀釋的HRP標記山羊抗小鼠IgG二抗，37 ℃反應30~40 min。加入 TMB 顯色液，50 μL/孔，顯色后用 2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀450 nm測定光吸收值。

1.2.5 HcM和HcW的免疫原性比較

20 μg/mL的HcM和HcW蛋白加入終濃度為1.5 mg/mL的Al(OH)3佐劑制成疫苗懸液，免疫6~8周齡雌性 Balb/c小鼠，0.5 mL/只進行腹部皮下注射，6只/組，同時設(shè)Al(OH)3佐劑陰性對照組，每2周免疫1次，共免疫3次，每次免疫后2周、下一次免疫前取血檢測血清中的抗體滴度；抗體滴度的測定采用ELISA的方法，破傷風類毒素1 μg/mL，100 μL/孔包被96孔酶聯(lián)板，4 ℃包被過夜。PBST洗滌4次，5 min/次。將抗血清用PBST從1∶100依次倍比稀釋后，加入酶聯(lián)板中，37 ℃反應1 h，同時設(shè)PBS免疫后的血清為對照。PBST洗滌4次，5 min/次。加入 HRP標記山羊抗小鼠 IgG二抗，37 ℃反應30~40 min。加入TMB顯色液，50 μL/孔，顯色后用2 mol/L H2SO4終止，酶標儀450 nm測定光吸收值。以加入陰性對照血清孔的顯色值為對照，以O(shè)D450大于0.1且高于陰性孔2倍為陽性稀釋滴度。1.2.6 HcM對小鼠的攻毒保護性

將破傷風毒素用硼酸鹽緩沖液稀釋，腹腔注射HcM和HcW免疫3次后的小鼠，每只小鼠注射0.5 mL，含1×103LD50的破傷風毒素，每組6只小鼠，同時設(shè)陰性對照組。攻毒后每天觀察并記錄小鼠的發(fā)病及存活情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 HcM的原核可溶性高表達

PCR擴增得到的 HcM 片段經(jīng)酶切后連接入原核表達載體pET32a(+) 中，在大腸桿菌BL21 (DE3)中獲得了高效可溶性表達 (圖 1)，目的蛋白分子量為50 kDa左右，主要以可溶性的形式存在于碎菌上清中，約占碎菌上清總蛋白的40%。

圖 1 HcM 在 BL21(DE3) 表達碎菌上清及沉淀中的SDS-PAGE蛋白電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE detection of HcM expressed in the ultrasonic supernatants of BL21(DE3). M: protein marker; 1:supernatant of pET32a(+)-HcM; 2: supernatant of pET32a(+);3: precipitation of pET32a(+)-HcM.

2.2 無標簽HcM的發(fā)酵與純化

HcM蛋白在30 L發(fā)酵罐中成功進行了發(fā)酵，發(fā)酵罐中pH控制在7.0±0.5，溶氧控制在30%~80%，通氣量3~6 L/min，罐壓控制在0~0.05 MPa，28 ℃誘導表達4 h后，收獲菌體沉淀，經(jīng)勻漿后離心收集表達上清，依次過Q Sepharose XL柱、Phenyl-HS柱和 source30Q柱進行純化，經(jīng)過三步純化后，無標簽的目的蛋白 Hc得到了很好地純化，純度可達95%以上 (圖2)，得率在300 mg/L以上，目的蛋白最終保存在PBS緩沖液中。

圖2 三步純化后獲得的HcM的SDS-PAGE蛋白電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE detection of purified HcM after 3 steps purification. M: protein marker; 1,2: purified HcM.

2.3 HcM的構(gòu)象穩(wěn)定性

將純化后的HcM和HcW分別在4 ℃、?20 ℃、?80 ℃放置不同時間，觀察它們的構(gòu)象穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明HcW存在多聚體及2種構(gòu)象形式的單體——氧化型和還原型，新鮮純化后的HcW主要以還原型為主，在4 ℃放置2 d后，HcW由還原型向氧化型轉(zhuǎn)變，2種單體構(gòu)象形式約各占一半；4 ℃放置7 d及2個月后，HcW主要以氧化型單體存在且多聚體也有明顯增加。而HcM在4 ℃放置2個月以上仍能保持構(gòu)象的穩(wěn)定 (圖 3)。HcW 和 HcM 在?20 ℃、?80 ℃放置不同時間后各構(gòu)象形式均基本穩(wěn)定 (數(shù)據(jù)未顯示)。

2.4 HcM與受體神經(jīng)節(jié)苷酯GT1b的結(jié)合活性

采用ELISA的方法檢測了HcM及HcW與破傷風毒素受體之一 GT1b的結(jié)合活性，結(jié)果表明 (圖4)，與HcW相比，HcM與GT1b的結(jié)合能力較弱，這也意味著HcM引起體內(nèi)病理學反應的幾率降低，從而可以降低副作用，更加適合用作人用疫苗。

2.5 HcM的免疫原性分析

采用Al(OH)3為佐劑，HcM和HcW為蛋白疫苗分別免疫小鼠3次，每2周免疫1次，從每次免疫后測得的小鼠抗破傷風類毒素滴度 (圖 5) 可以看出，第1次免疫后 2周，2組小鼠抗體的平均滴度均在1∶500左右；第2次免疫后，兩組小鼠抗體的平均滴度均高于 1∶10 000，且 HcM 組略高于HcW組；第3次免疫后，2組小鼠抗體的滴度均為 1∶100 000左右，且2組小鼠的抗體滴度之間無明顯差別。

圖3 HcW和HcM在4 ℃放置不同時間的構(gòu)象穩(wěn)定性Fig. 3 The conformational stability of HcW and HcM at 4 °C for different time. A: 4 °C for 0 d; B: 4 °C for 2 d; C: 4 °C for 7 d; D:4 °C for 2 months. M: protein marker.

圖4 不同濃度的HcW和HcM與神經(jīng)節(jié)苷酯GT1b的結(jié)合活性Fig. 4 The binding of GT1b with HcW and HcM in different concentration.

圖5 HcW和HcM免疫小鼠后不同時間測得的抗破傷風類毒素抗體滴度Fig. 5 The anti-tetanus toxoid antibody titers of mice after HcW and HcM immunization.

表1 HcW和HcM作為亞單位疫苗對小鼠的體內(nèi)保護作用Table 1 In vivo protection of HcW and HcM used as sub-unit vaccine

2.6 HcM對小鼠的攻毒保護性

用含1×103LD50的破傷風毒素攻擊免疫3次后的小鼠，觀察小鼠的存活情況，從實驗結(jié)果 (表 1)可以看出，10 μg的 HcM 可以完全保護小鼠抵御1×103LD50的破傷風毒素攻擊，其保護效果同HcW相當。

3 討論

破傷風毒素的毒性非常強烈，僅次于肉毒毒素，約100 ng的破傷風毒素便可以致人死亡，因此極有可能被用于生物戰(zhàn)劑。1997年召開的生物武器公約締約國政府專家特設(shè)小組第七次會議確定的生物戰(zhàn)劑標準與戰(zhàn)劑病原體清單中，破傷風毒素被列為用于攻擊人的毒素。安全、有效的破傷風疫苗對于部隊的平、戰(zhàn)時均具有特殊意義，在進行野外作戰(zhàn)、執(zhí)行維和任務及抗震救災時可作為藥品儲備及安全保障。一切開放性的傷口均由發(fā)生破傷風的可能，隨著我國飼養(yǎng)寵物的家庭越來越多，感染破傷風的風險和幾率也在逐漸擴大，基因工程破傷風亞單位疫苗的研制成功，將使廣大民眾能接種安全有效的新型疫苗，減少破傷風發(fā)病率，具有良好的應用前景。

目前國內(nèi)外均沒有重組破傷風疫苗臨床前或臨床研究的報道，原因是表達純化的Hc蛋白存在表達量較低、易形成包涵體且免疫原性低等問題。本實驗室已經(jīng)在大腸桿菌中成功獲得了野生型 HcW 蛋白的可溶性高表達，其免疫原性與類毒素相當，但由于破傷風毒素HcW片段在869、1077、1 093和1 301位存在4個半胱氨酸cys，其中869位和1 093位的cys易形成分子內(nèi)二硫鍵，其余的cys可形成分子間二硫鍵[12]，因此其構(gòu)象極其不穩(wěn)定，這給疫苗后續(xù)的生產(chǎn)工藝帶來了一定的困難，因此，本研究通過將Hc片段869位關(guān)鍵的cys突變?yōu)锳la，使其形成條帶均一、構(gòu)象穩(wěn)定的蛋白HcW，并且對其蛋白穩(wěn)定性、受體結(jié)合能力及免疫原性進行了分析，實驗結(jié)果表明突變后的蛋白保持了單一的單體構(gòu)象，在4 ℃放置2個月以上仍能保持構(gòu)象的穩(wěn)定；盡管與 HcW 相比，HcM與受體神經(jīng)節(jié)苷酯 GT1b的結(jié)合活性略有下降，但這也意味著HcM在體內(nèi)引起的病理反應也會相應減少，從而減少疫苗的毒副作用。但突變后的HcW仍能夠誘導小鼠產(chǎn)生高滴度的抗破傷風類毒素抗體，并能保護小鼠抵御至少1×103LD50的破傷風毒素的攻擊。

構(gòu)象穩(wěn)定的破傷風HcW蛋白具有開發(fā)成為新型破傷風重組亞單位疫苗的潛力，其成功研制可為破傷風的預防提供一條更加安全、有效、簡便的道路。

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Production and immunogenicity analysis of conformation-stable fragment-C mutant of tetanus toxin

Rui Yu, Lihua Hou, Shuling Liu, Changming Yu, Xiaoyan Zhang, Ying Liu, and Wei Chen
State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, China

Received: July 8, 2010; Accepted: November 12, 2010

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2006CB504404), Important National Science and Technology Specific Projects (No. 2008ZX10003-010), National Department Public Benefit Research Foundation (No. 200903027).

Corresponding author: Xin’an Jiao. Tel: +86-514-87971803; E-mail: jiao@yzu.edu.cn*These authors contributed equally to this work.

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2006CB504404)，國家科技重大專項 (No. 2008ZX10003-010)，公益性行業(yè)科研專項 (No. 200903027)資助。