陳小睿，田會萍，李佳川，孟憲麗

點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 610075

腦缺血卒中是嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見危急重癥。以川芎為代表的活血化瘀中藥對腦缺血卒中具有獨到療效?，F(xiàn)代研究認(rèn)為川芎嗪、阿魏酸等為川芎治療心腦血管疾病的主要成分，而針對川芎揮發(fā)油應(yīng)用于腦血管病治療的研究報道較少。通脈醒腦滴丸是以川芎揮發(fā)油為主要組方原料的中藥制劑。本文通過觀察通脈醒腦滴丸對缺血再灌注大鼠模型的腦保護(hù)作用，初步探討其可能的作用機(jī)制，以期為尋找川芎防治腦缺血新的作用部位提供參考。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物

通脈醒腦滴丸(10 mg/粒，成都潤華藥業(yè)有限公司，批號:070530);尼莫地平片(20 mg/片，山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號:070109)

1.2 實驗試劑

SOD試劑盒、MDA試劑盒、NO試劑盒、GSH－Px試劑盒和考馬斯亮蘭試劑盒(南京建成生物工程研究所)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

722S型分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)、BP221S型電子天平(SARTORIUS)、DHW－600型不銹鋼電熱恒溫水箱(北京國華醫(yī)療器械廠)、醫(yī)用超低溫冰箱(日本SANYO)、LD2－5醫(yī)用離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)等。

1.4 動物

SD大鼠，SPF級，體重300±20 g，雌雄各半，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供(合格證號:SCXK(川)2004－15)

2 實驗方法和結(jié)果

2.1 動物分組和給藥劑量及方法

健康SD大鼠210只，雌雄各半，隨機(jī)將每批大鼠分為7組:第1組為假手術(shù)組;第2組為模型組;第3、4、5、6組分別為通脈醒腦滴丸大鼠1組、2組、3組和4組;第7組為陽性對照尼莫地平組。每組30只，分3批進(jìn)行實驗。第一批用于測定腦組織含水率，第二批用于觀察行為學(xué)表現(xiàn)和測定腦組織梗死率，第三批用于腦組織勻漿的生化檢查，每批每組各10只。

通脈醒腦滴丸各組灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7日。假手術(shù)組及模型組給予等容積蒸餾水。第7天給藥1 h后，假手術(shù)組大鼠僅在麻醉狀態(tài)下分離右側(cè)頸總動脈，不予阻斷血流。陽性組、模型組和各給藥組按照下述2.2所示方法建立大鼠右側(cè)大腦中動脈栓塞再灌注模型。再灌注第23 h后給藥一次，第24 h頸椎脫位處死動物取腦。

2.2 大鼠線栓法致局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO)的制備

參照文獻(xiàn)報道［1～3］，第7天給藥1 h后，線栓阻斷大腦中動脈(MCA)，2 h后拔出線栓實現(xiàn)再灌注。以動物蘇醒后出現(xiàn)提尾時左前肢屈曲或前進(jìn)時左側(cè)劃圈征為右側(cè)大腦中動脈阻塞成功標(biāo)志。

2.3 統(tǒng)計方法

運(yùn)用SPSS 13.0 For Windows軟件提供的非參數(shù)檢驗(Nonparametric Tests)和方差分析(ONE－WAY ANOVA)進(jìn)行處理。

2.4 大鼠行為學(xué)評分的測定

大鼠處死之前，根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》第三版記載的評分標(biāo)準(zhǔn)［4］，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，分?jǐn)?shù)越高，動物行為障礙越嚴(yán)重。實驗結(jié)果見表1。

表1 通脈醒腦滴丸對線栓法致局灶性腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)的影響()

表1 通脈醒腦滴丸對線栓法致局灶性腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)的影響()

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

神經(jīng)行為學(xué)評分假手術(shù)組 等容積蒸餾水 10組別 劑量(mg·kg－1) 動物數(shù)(只)—模型組 等容積蒸餾水 10 7.5±1.6通脈醒腦滴丸大鼠1組 147.70 10 5.1±1.9*通脈醒腦滴丸大鼠2組 73.85 10 5.2±1.9*通脈醒腦滴丸大鼠3組 36.93 10 6.2±2.5通脈醒腦滴丸大鼠4組 18.46 10 6.7±2.2尼莫地平組 10.00 10 4.6±1.9＊＊

由表1可見，通脈醒腦滴丸大鼠1組、2組神經(jīng)功能缺損有所改善(P＜0.01～0.05)。通脈醒腦滴丸大鼠3組和4組較之模型組，神經(jīng)功能缺損有改善的趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 腦組織含水率的測定

大鼠頸椎脫位處死。取腦，沖洗并吸干表面水分，電子天平精確稱量濕重，入烘箱105℃烘干48 h后取出，經(jīng)反復(fù)稱量直至恒重后(每天稱一次，直至兩次重量變化小于1%)，記錄作為組織干重。用干濕重法求得含水率，公式如下:

腦組織含水率(%)=(濕重－干重)/濕重×100%實驗結(jié)果見表2。

從表2可見，通脈醒腦滴丸大鼠1組、大鼠2組、大鼠3組三個劑量組的腦水腫程度有所降低(P＜0.01～0.05)。

2.6 腦梗死比率的測定

大鼠頸椎脫位處死。取腦，冠狀面均勻切成約2 mm的厚腦片，放入1%TTC磷酸緩沖溶液中，水浴鍋避光37℃溫孵30 min后，取出置于10%甲醛中避光固定24 h，濾紙吸干表面液體，電子天平精密稱取總重并記錄。眼科鑷精確剝離梗死部位，精密稱量并記錄。腦梗死比率測定采用公式:

腦梗死比率(%)=(梗死部分重量/全腦重量)×100%

實驗結(jié)果見表3。

表2 通脈醒腦滴丸對線栓法致局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織含水率的影響()

表2 通脈醒腦滴丸對線栓法致局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織含水率的影響()

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量(mg·kg－1) 動物數(shù)(只) 腦組織含水率(%)假手術(shù)組 等容積蒸餾水 10 78.64±1.72＊＊模型組 等容積蒸餾水 10 81.87±0.70通脈醒腦滴丸大鼠1組 147.70 10 79.97±0.94＊＊通脈醒腦滴丸大鼠2組 73.85 10 80.67±0.74*通脈醒腦滴丸大鼠3組 36.93 10 80.81±0.56*通脈醒腦滴丸大鼠4組 18.46 10 80.89±1.64尼莫地平組 10.00 10 79.83±0.76＊＊

表3 對線栓法致局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死比率的影響()

表3 對線栓法致局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死比率的影響()

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量(mg·kg－1) 動物數(shù)(只) 腦梗死比率(%)假手術(shù)組 等容積蒸餾水 10—模型組 等容積蒸餾水 10 12.67±1.28通脈醒腦滴丸大鼠1組 147.70 10 8.96±1.36＊＊通脈醒腦滴丸大鼠2組 73.85 10 10.13±1.86＊＊通脈醒腦滴丸大鼠3組 36.93 10 11.16±1.5*通脈醒腦滴丸大鼠4組 18.46 10 11.24±1.42*尼莫地平組 10.00 10 7.56±1.12＊＊

從表3可見，通脈醒腦滴丸各組均能降低大鼠腦梗死比率(P＜0.01～0.05)。

2.7 對線栓法致大鼠腦缺血再灌注模型自由基氧化損傷的影響

各組大鼠再灌注23 h后，給藥一次。給藥1 h后，即再灌注24 h，股動脈放血處死大鼠。取腦后于冰盤上去除嗅球、小腦及腦干，用生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙吸干，立即稱濕重。按1:9(W/V)加入生理鹽水，冰水浴研制10%腦組織勻漿液，4000轉(zhuǎn)/分冷凍離心10 min，取上清液超低溫冰箱保存。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，采用722分光光度計，黃嘌呤氧化酶法550 nm處測定SOD活力、硫代巴比妥酸法532 nm處測定MDA含量、硝酸還原酶法550 nm處測定NO含量、化學(xué)發(fā)光法412 nm處測定GSH－Px活力、考馬斯亮蘭法595 nm處測定組織勻漿上清液蛋白含量。實驗結(jié)果見表4。

表4可見，通脈醒腦滴丸大鼠1組能明顯增加SOD和GSH－Px的活性(P＜0.01～0.05)，降低 MDA和NO的含量(P＜0.01～0.05);通脈醒腦滴丸大鼠2組能提高SOD活力，降低MDA的含量(P＜0.05);通脈醒腦滴丸大鼠3組可降低MDA和NO的含量(P＜0.05)。

表4 通脈醒腦滴丸對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織SOD活性、MDA、NO含量、GSH－Px活力的影響(，n=10)

表4 通脈醒腦滴丸對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織SOD活性、MDA、NO含量、GSH－Px活力的影響(，n=10)

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

組別 劑量(mg·kg－1) SOD(U·mgprot－1) MDA(nmol·mgprot－1) NO(μmol· gprot－1) GSH－Px(活力單位)假手術(shù)組 等容積蒸餾水 108.19±18.40＊＊ 3.16±1.02＊＊ 3.51±0.75＊＊ 106.40±12.14＊＊模型組 等容積蒸餾水 68.03±17.96 4.99±1.33 5.59±1.18 78.79±13.42通脈醒腦滴丸1組 147.70 95.70±18.19＊＊ 3.63±1.11＊＊ 4.42±1.13* 90.71±12.14*通脈醒腦滴丸2 組 73.85 86.37±8.80* 3.97±0.99* 4.81±1.13 87.48±7.46通脈醒腦滴丸3 組 36.93 80.86±11.90 4.01±0.47* 4.60±1.06* 85.29±6.54通脈醒腦滴丸4 組 18.46 81.85±20.40 4.61±1.10 4.73±0.99 86.86±11.31尼莫地平組 10.00 90.26±17.07＊＊ 3.35±0.66＊＊ 4.42±0.60* 91.52±10.86＊＊

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)含有豐富的不飽和脂肪酸，較易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。腦缺血時，自由基生成過多，引發(fā)強(qiáng)烈的鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。當(dāng)再灌注組織重新獲得氧的供應(yīng)，更易誘發(fā)“氧爆發(fā)”，加重組織損害。

生理條件下人體細(xì)胞內(nèi)存在的自由基清除劑包括超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)等，反映了機(jī)體清除自由基的能力。丙二醛(MDA)為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，?？梢苑从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。

NO具有神經(jīng)毒性，是谷氨酸興奮毒性的主要介質(zhì)，還可通過過氧化亞硝基陰離子(ONOO—)使線粒體內(nèi)錳超氧化物歧化酶(Mn－SOD)失活，或再分解為具有更強(qiáng)神經(jīng)毒性的羥基及二氧化氮(NO2—)自由基［5］，加重缺血再灌注損傷［6］。

研究認(rèn)為［7］，大量自由基可以使血清內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物含量明顯增加，導(dǎo)致血粘度升高，血小板聚集性增強(qiáng)，易于形成血栓，造成脈道失利，血行障礙。許多活血化瘀中藥如川芎、丹參、三七等被認(rèn)為是有效的天然自由基清除劑，可通過抑制自由基的生成，直接參與對自由基的清除、調(diào)節(jié)與自由基代謝相關(guān)的酶類來減輕自由基氧化損傷。

本實驗結(jié)果顯示，以川芎揮發(fā)油為主要組方原料的通脈醒腦滴丸，能改善腦缺血后的組織損傷，減輕腦水腫，改善動物的神經(jīng)功能癥狀，其機(jī)制與川芎揮發(fā)油降低缺血再灌注大鼠的腦組織MDA和NO的含量，升高SOD和GSH－Px的活性，改善自由基防御系統(tǒng)，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)相關(guān)。本實驗的結(jié)果，也為川芎揮發(fā)油制劑臨床用于缺血性腦血管病的防治提供了藥理學(xué)依據(jù)。

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