陰春暉,李培琴,趙江林,單體江,何桂玲,周立剛

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,北京 100193

從盾葉薯蕷組培苗中高壓酸解制備薯蕷皂苷元

陰春暉,李培琴,趙江林,單體江,何桂玲,周立剛＊

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,北京 100193

采用正交試驗(yàn)法對(duì)盾葉薯蕷 (D ioscorea zingiberensis)組培苗中薯蕷皂苷元的高壓酸解制備工藝進(jìn)行了研究。以薯蕷皂苷元的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo),選用正交表 L16(45),以樣品用量、硫酸濃度、提取時(shí)間為因素,設(shè)計(jì)了3因素 4水平的正交試驗(yàn)。結(jié)果表明:高壓酸解提取薯蕷皂苷元的最佳工藝條件為:樣品用量 25 mg、硫酸濃度0.5 mol/L、提取時(shí)間 2 h,在此條件下提取物中薯蕷皂苷元的平均含量為 9.12 mg/g。

盾葉薯蕷;薯蕷皂苷元;高壓酸解;正交試驗(yàn)

Abstract:Acidolysis preparation of diosgenin at high pressure from the cultured plantlets ofD ioscorea zingiberensiswas studied byL16(45)orthogonal experiments.The effects of sample quantity,concentration of sulfuric acid,and extraction time were investigated.The results showed that diosgenin content of the plantlets reached 9.12 mg/g under the optimum extraction condition thatwas 25 mg of sample,0.5 mol/L of sulfuric acid,and 2 h of extraction t ime.

Key words:D ioscorea zingiberensis;diosgenin;acidolysis preparation at high pressure;orthogonal experiments

盾葉薯蕷 (D ioscorea zingiberensisC.H.W right)分類學(xué)上屬于單子葉百合目 (Liliales)薯蕷科 (Dioscoreaceae)薯蕷屬[1],以根狀莖入藥,主要活性成分為薯蕷皂苷元 (俗稱皂素),含量為 1.1%～16.2%,居世界薯蕷屬植物之冠[2]。薯蕷皂苷元是合成皮質(zhì)激素、性激素和蛋白同化激素等甾體類藥物的重要原料,因此被稱為醫(yī)藥界的“藥用黃金”[3]。

薯蕷皂苷元在植物中很少以游離態(tài)形式存在,一般以苷元與糖基形成皂苷的形式存在,人們一般是從植物組織中提取分離出含有薯蕷皂甙元或類似結(jié)構(gòu)的皂苷,然后轉(zhuǎn)化成薯蕷皂苷元。迄今為止,提取薯蕷皂苷元的方法主要有:酸水解法[4]、索氏提取法[5]、近臨界水解法[6]、回流提取法[7]、直接與自然發(fā)酵法[8,9]、水解原位萃取法[10]、酶解法[11]、超聲提取[12]、超臨界流體萃取[4]等。高壓酸解制備薯蕷皂苷元的方法是在常壓酸解的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,一般是在 0.1～0.2MPa壓力條件下進(jìn)行酸水解,能有效地提取組織內(nèi)的薯蕷皂苷元[13,14]。

薯蕷皂苷元經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,市場(chǎng)需求大,由于資源的采挖過(guò)度,自然存量急劇減少[15]。為了保護(hù)日益枯竭的薯蕷資源和滿足市場(chǎng)對(duì)薯蕷皂苷元的需求,我們可以利用生物技術(shù)方法 (試管微繁殖和細(xì)胞大量培養(yǎng))生產(chǎn)薯蕷皂苷元[3,16]。通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)盾葉薯蕷,既可保存種質(zhì)資源,又能快速繁殖優(yōu)良品種[16]。在諸多的研究 (如代謝調(diào)控)中,薯蕷皂苷元的提取與含量分析是非常重要的環(huán)節(jié),工作量大,因此有必要建立一種快速、微量提取薯蕷皂苷元的方法。本研究采用高壓 (1.05 kg/cm2、121℃)酸水解的方法,提取盾葉薯蕷組培苗中的薯蕷皂苷元,為高效率分析盾葉薯蕷培養(yǎng)物(包括組培苗)中的薯蕷皂苷元含量,以及將來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)組培苗或培養(yǎng)細(xì)胞獲得薯蕷皂苷元提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

盾葉薯蕷 (D ioscorea zingiberensis)組培苗由武漢大學(xué)李家儒教授贈(zèng)送。將盾葉薯蕷組培苗置于光照培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件為:25℃,每天連續(xù)光照 12 h,光強(qiáng)為 2000 lx,MS基本培養(yǎng)基 (未添加激素),每28 d繼代培養(yǎng) 1次。根據(jù)本研究小組前期結(jié)果[17],確定培養(yǎng) 28 d為組培苗合成薯蕷皂苷元的收獲期。

1.2 儀器與試劑

微量電子天平 (AL104型,Mettler Toledo儀器上海有限公司);數(shù)控超聲波清洗器 (KQ5200DE型,昆山市超聲儀器有限公司);光照培養(yǎng)箱 (RXZ智能人工氣候箱,寧波江南儀器廠);立式壓力蒸汽滅菌器(LS-B55L型,江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠);紫外可見分光光度計(jì) (TU-1810型,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);薯蕷皂苷元的標(biāo)準(zhǔn)品 (純度 98%,由武漢大學(xué)李家儒教授提供);濃硫酸、高氯酸、香草醛、冰醋酸、石油醚、無(wú)水硫酸鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品,均為分析純。

1.3 薯蕷皂苷元提取物的制備

選擇生長(zhǎng)均一的盾葉薯蕷組培苗,60℃干燥后研磨成粉,根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 (表 1),準(zhǔn)確稱取不同重量的盾葉薯蕷組培苗粉末于試管中,加入 5 mL 95%乙醇和 5 mL不同濃度的 H2SO4,室溫放置1 d后超聲提取 2 h,然后在 121℃高壓 (1.05 kg/cm2≈ 0.10 MPa)下酸解不同時(shí)間,除去樣品殘?jiān)?用 45 mL石油醚分 3次進(jìn)行萃取,合并提取液,先后用 1 mol/L NaOH和蒸餾水洗滌 2次,收集石油醚層,用無(wú)水Na2SO4去水,真空濃縮至干,得到薯蕷皂苷元提取物,采用分光光度法測(cè)定提取物中薯蕷皂苷元的含量。

1.4 高壓酸解工藝設(shè)計(jì)

對(duì)影響薯蕷皂苷元提取率的 3個(gè)主要因素:樣品用量 (A)、硫酸濃度 (B)、提取時(shí)間 (C)進(jìn)行考察。按 L16(45)正交表 (表 1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每個(gè)處理設(shè) 3個(gè)重復(fù),以薯蕷皂苷元含量作為考察指標(biāo),探討最佳提取工藝條件。

表1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal exper iment

3 75 1.0 3.0 4 100 1.5 0.5

1.5 薯蕷皂苷元的含量分析

精確稱取 5 mg薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品于 5 mL容量瓶中,用石油醚溶解并定容至刻度線,配成 1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)母液。依次取 0、30、40、50、60、70、80和 90μL薯蕷皂苷元母液于刻度試管中,揮干溶劑,先后加入0.1 mL 5%香草醛-醋酸液和 0.4 mL高氯酸,于 70℃水浴上不斷振搖,保溫 30 min,取出后置于冰水終止反應(yīng),加冰醋酸至 5 mL刻度線,搖勻備用,室溫放置 10 min,在 400～700 nm區(qū)間掃描得最大吸收波長(zhǎng)為 451 nm。以 5 mL反應(yīng)體積中薯蕷皂苷元的濃度 (μg/mL)為橫坐標(biāo) (X),451nm吸光值為縱坐標(biāo)(Y),建立線性回歸方程:Y=0.0368X-0.0028,R=0.9951,根據(jù)方程計(jì)算樣品中薯蕷皂苷元含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析,得出各處理之間的顯著性差異關(guān)系。采用 SAS軟件,顯著性差異水平為 0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)

正交優(yōu)選高壓酸解提取薯蕷皂苷元的工藝研究結(jié)果見表 2,通過(guò) SAS分析,2號(hào)方案 (A1B2C2)中薯蕷皂苷元產(chǎn)量極顯著地高于其余 15個(gè)實(shí)驗(yàn)方案,3個(gè)重復(fù)的薯蕷皂苷元含量分別為:8.91 mg/g、9.39 mg/g和 9.08 mg/g,平均含量達(dá)到 9.13 mg/g。綜合來(lái)看,2號(hào)方案 (A1B2C2:樣品用量 25 mg、硫酸濃度 0.5 mol/L、提取時(shí)間 2 h)為最佳實(shí)驗(yàn)方案。

從極差分析 R值的大小可以看出各因素對(duì)薯蕷皂苷元含量的影響作用大小次序?yàn)?A＞C＞B＞E＞D,表明樣品用量是對(duì)高壓酸解提取薯蕷皂苷元含量影響最大的因素,其次為提取時(shí)間,再次為硫酸濃度。誤差列 D和 E的 R值均小于 3個(gè)因素,說(shuō)明3個(gè)因素沒(méi)有交互作用或三者的交互作用對(duì)薯蕷皂苷元含量 (或稱提取產(chǎn)量)影響不明顯。

2.2 方差分析

為了驗(yàn)證各因素對(duì)高壓酸解提取薯蕷皂苷元得率 (含量)影響的差異及其造成這種影響的原因,我們對(duì)高壓酸解正交試驗(yàn)進(jìn)行了多因素方差分析和 F檢驗(yàn) (結(jié)果見表 3),可以看出:本實(shí)驗(yàn)所考察的 3個(gè)因素的 F值均大于 F0.01,表明這 3個(gè)因素對(duì)薯蕷皂苷元得率的影響均達(dá)到極顯著水平。

由于 F值的大小表示著效應(yīng)的大小,在本實(shí)驗(yàn)所考察的 3個(gè)因素中,對(duì)薯蕷皂苷元含量的影響作用大小次序?yàn)?A＞C＞B,與極差分析結(jié)果保持一致。通過(guò)對(duì) 3個(gè)因素各水平間的薯蕷皂苷元含量進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),結(jié)果表明A1B2C2組合為最佳的高壓酸解組合,在此條件下的薯蕷皂苷元含量最高。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and results

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance of the orthogonal exper iments

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按以上最佳提取條件 (A1B2C2組合),重復(fù)進(jìn)行了 4次試驗(yàn),所得提取物中薯蕷皂苷元的平均含量為 9.12 mg/g,重現(xiàn)性較好。

3 討論

在常規(guī)酸水解和回流提取方法中,所需的硫酸量是很大的,并且一次回流提取只能處理 1個(gè)樣品。比如采用二步索氏提取法[5],先用甲醇回流 4 h,再用濃度為 2.5 mol/L的硫酸水解 6 h,最后用汽油回流 2 h,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng),對(duì)于進(jìn)行多個(gè)處理的實(shí)驗(yàn)既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。通過(guò) L16(45)正交試驗(yàn),我們可以確定高壓酸解提取薯蕷皂苷元的最佳提取條件為:樣品用量 25 mg、硫酸濃度 0.5 mol/L、提取時(shí)間2 h,在此條件下薯蕷皂苷元的平均含量是 9.12 mg/g。高壓酸解提取方法不僅縮短了提取時(shí)間,降低了硫酸的使用量,并且一次可對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行處理,提高了工作效率。本研究通過(guò)對(duì)高壓酸解制備薯蕷皂苷元的工藝進(jìn)行優(yōu)化,為今后從盾葉薯蕷培養(yǎng)物中有效制備薯蕷皂苷元和高通量分析樣品中薯蕷皂苷元的含量創(chuàng)造了條件。

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Acidolysis Preparation of Diosgen in at High Pressure from the Cultured Plantlets of Dioscorea zingiberensis

Y IN Chun-hui,LI Pei-qin,ZHAO Jiang-lin,SHAN Ti-jiang,HE Gui-ling,ZHOU Li-gang＊
College of Agronomy and B iotechnology,China AgriculturalUniversity,Beijing 100193,China

R931.71;Q949.9

A

1001-6880(2011)01-0114-04

2010-07-05 接受日期:2010-09-09

北京市自然科學(xué)基金 (6092015);國(guó)家自然科學(xué)基金(30871662,31071710)

＊通訊作者 Tel:86-10-62731199;E-mail:lgzhou@cau.edu.cn