涂 璇,薛秀園,涂國(guó)全

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,南昌 330045

紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌機(jī)制的研究

涂 璇,薛秀園,涂國(guó)全＊

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,南昌 330045

紅谷霉素是一種抗細(xì)菌的新型抗生素。為探討紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制,本文采用濃度為 EC50和 EC90的紅谷霉素對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行處理,并設(shè)空白對(duì)照,測(cè)定供試菌株的胞外多糖、細(xì)胞膜滲透性和生物大分子 (DNA、RNA、蛋白質(zhì)和胞外酶活性)。結(jié)果顯示:紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用首先表現(xiàn)在對(duì)核酸合成的抑制,由于核酸的合成受阻,引起菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)和其它的生物大分子的合成受阻,細(xì)菌細(xì)胞膜通透性改變。透視電鏡照片顯示:紅谷霉素處理后金黃色葡萄球菌菌體內(nèi)部的原生質(zhì)體明顯變稀。

紅谷霉素;金黃色葡萄球菌;抑菌機(jī)制

Abstract:Honggumycin is a kind of new antibiotic.UsingStaphalococcus aureusas the experimental bacterial,the antibacterialmechanis m of Honggumycin was investigated.The experimental bacterialwas treated with Honggumycin at the concentration of EC50and EC90,with no Honggumycin as blank control.And the EPS,plas malemma transparence,and biomolecular(DNA,RNA,and protein)were determined.The results showed that the antibacterial activity of Honggumycin toS.aureuswas presented in inhibiting the synthesis of nuclei acid.The synthesis of protein and other biomolecular were restrained due to the inhibition of nuclei acid synthesis,and the plas malemma permeability was changed.Electron microscope photograph showed the protoplast ofS.aureushad become thin after treatingwith Honggumycin.

Key words:Honggumycin;Staphalococcus aureus;antibacterialmechanis m

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院應(yīng)用微生物研究室在以棉花枯萎病菌為靶目標(biāo)開(kāi)展農(nóng)抗生產(chǎn)菌的分離篩選研究中,從土壤中分離篩選到一株鏈霉菌,命名為鏈霉菌 702。其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)對(duì)棉花枯萎病菌有較強(qiáng)的抑菌活性,進(jìn)一步測(cè)定它的抗菌譜,發(fā)現(xiàn)其所產(chǎn)生生物活性物質(zhì)既能抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,又能抑制革蘭氏陰性細(xì)菌,同時(shí)還能抑制霉菌和酵母菌[1]。毒理實(shí)驗(yàn)表明其為無(wú)毒物質(zhì),而且通過(guò)對(duì)鏈霉菌 702生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性研究測(cè)定表明其對(duì)熱和紫外線穩(wěn)定,在 pH3～12條件下穩(wěn)定[2]。這些初步研究結(jié)果已顯示了其作為防腐劑的廣闊前景。鏈霉菌 702所產(chǎn)抗細(xì)菌組分經(jīng)紫外、紅外、質(zhì)譜、核磁共振和 X衍射等測(cè)定,結(jié)果表明該活性組分與放線菌素 X2同質(zhì),為國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn),命名為紅谷霉素。本論文在總結(jié)前人工作的基礎(chǔ)上,以金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌株,探索紅谷霉素對(duì) G+金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)體的抗菌作用性質(zhì)。通過(guò)紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性和毒力測(cè)定,探索紅谷霉素的抑菌能力,為紅谷霉素的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 紅谷霉素純品 (含量 99.47%)

由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程院提供。

1.1.2 抑菌測(cè)定指示菌

金黃色葡萄球菌(Staphalococcus aureus)

1.1.3 培養(yǎng)基[3]

①指示菌斜面培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;②指示平板培養(yǎng)基:GPP培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌DNA作用影響的測(cè)定

1.2.1.1 DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

取 6支試管,按表 1添加試劑?；靹蚝笥?60℃恒溫水浴保溫 60 min,冷卻后以 0號(hào)管作對(duì)照,于595 nm處測(cè)定A595,以DNA濃度為橫坐標(biāo),光吸收值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)表 1。

表1 DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定Table 1 The determination ofDNA specification curve

1.2.1.2 供試樣品中的DNA含量測(cè)定

DNA的含量測(cè)定采用改良的二苯胺法。將供試菌在 GPP培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,再分為 3瓶,處理紅谷霉素,使菌液紅谷霉素的最終濃度為 EC90、EC50、對(duì)照加無(wú)菌水,30℃ 120 r/min繼續(xù)培養(yǎng);分別于加藥前、加藥后 1、3、6 h取樣。然后采用有機(jī)溶劑抽提法分離提取樣品中 DNA,將上層的水相和下層的有機(jī)溶劑層分開(kāi)保存。取上層水相按DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法進(jìn)行DNA含量的測(cè)定。

1.2.2 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌 RNA作用影響的測(cè)定

表2 RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定Table 2 The determination of RNA specification curve

1.2.2.2 供試樣品中 RNA含量的測(cè)定

RNA含量測(cè)定采用改良苔黑酚法。將供試菌在 GPP培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,再分為 3瓶,處理紅谷霉素,使菌液紅谷霉素的最終濃度為EC90、EC50、對(duì)照加無(wú)菌水,30 ℃,120 r/min繼續(xù)培養(yǎng);分別于加藥前、加藥后 1、3、6 h取樣。然后采用熱酚法提取樣品中 RNA,再按 RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)作用影響的測(cè)定

1.2.3.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

取 6支試管,按表 3添加試劑?；靹蚝蠓胖?2 min后,在 595 nm下比色,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)表 3。

表3 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定Table 3 The deter mination of protein from zero to a hundredμg/mL specification curve

1.2.2.1 RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

取試管 6支,按表 2添加試劑?；靹蚝笾?100℃恒溫水浴保溫 45 min,以 0號(hào)管為對(duì)照,于 670 nm處測(cè)定光吸收值 A670,以 RNA濃度為橫坐標(biāo),光吸收值為縱坐標(biāo)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)表 2。

1.2.3.2 供試樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。將供試菌在GPP培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,再分為 3瓶,處理紅谷霉素,使菌液紅谷霉素的最終濃度為EC90、EC50、對(duì)照加無(wú)菌水,30 ℃,120 r/min繼續(xù)培養(yǎng);分別于加藥前、加藥后 1、3、6 h取樣。然后采用有機(jī)溶劑抽提法分離提取樣品中蛋白質(zhì),再按蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 紅谷霉素對(duì)供試菌體胞外多糖 (EPS)作用影響的測(cè)定[4]

將 0.1 mL菌體懸浮液分別均勻涂布于含紅谷霉素低于有效抑制中濃度 EC50系列濃度的 GPP平板上,28～30℃培養(yǎng) 2 d,收集菌落,用定量的無(wú)菌水洗下 EPS,離心上清液用粘度計(jì)算其粘度,菌體烘干后稱量,計(jì)算相對(duì)粘度值 (每毫升上清液粘度 /每毫克菌體干重),并比較紅谷霉素對(duì)菌體 EPS生物合成和菌體生長(zhǎng)速度速率的影響。

1.2.5 紅谷霉素對(duì)菌體細(xì)胞膜滲透性作用影響的測(cè)定

將供試菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期,離心收集菌體,用 1%NaCl溶液洗滌離心,重復(fù) 2次,再將菌體懸浮于 1%NaCl溶液中,加紅谷霉素,使最終濃度為供試細(xì)菌的 EC50處理,置于 30℃條件下,分別于 0、3、6、12 h,取樣離心,收集上清液,用紫外分光光度計(jì)測(cè) 220～380 nm間的吸收峰型及 260 nm吸收物含量變化。

1.2.6 紅谷霉素對(duì)菌體作用前后菌體形態(tài)的變化的測(cè)定

挑取在平板上分離較好的單個(gè)菌落接種于 GPP液體培養(yǎng)基中,于 37℃過(guò)夜培養(yǎng),進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。再轉(zhuǎn)接于新鮮的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,加入稀釋好的紅谷霉素,使培養(yǎng)液中紅谷霉素的濃度為 10倍殺菌濃度,分別取加藥前和加藥后的 3 h的菌液,離心收集菌體。

收集處理前后的菌體,用 0.1 mol/L的磷酸緩沖液洗滌菌體兩次,棄緩沖液,加入 2.5%戊二醛固定液,混勻菌體,于 4℃固定過(guò)夜;離心收集菌體,加入溶解后冷卻至 50℃左右的 1.5%的瓊脂糖,用牙簽輕輕將沉淀挑起來(lái),確保菌體全部包埋進(jìn)瓊脂糖中。待凝固后,用刀片切去多余的部分,把有樣品的留下,切成小長(zhǎng)條,重新放入固定液中。

用 0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗樣品 6次,每次 20 min;然后用 1%鋨酸 4℃冰箱中固定 2 h,再用 0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗樣品 6次,每次 10 min;再經(jīng) 50%、70%、80%、90%、100%(含 CuSO4)的酒精依次脫水,每次 10 min;再用環(huán)氧丙烷、環(huán)氧丙烷 +硫酸銅各處理 10 min;環(huán)氧丙烷:環(huán)氧樹(shù)脂 3∶1,處理 1 h;環(huán)氧丙烷 ∶環(huán)氧樹(shù)脂 1∶1,處理 2 h;環(huán)氧丙烷∶環(huán)氧樹(shù)脂 1∶3,處理 30 min;環(huán)氧樹(shù)脂保存過(guò)夜。

最后用 Epon818樹(shù)脂包埋、超薄切片、染色。制好的樣品在透射電鏡下觀察并記錄結(jié)果、拍照。

1.2.7 紅谷霉素對(duì)細(xì)菌產(chǎn)胞外酶作用影響的測(cè)定

胞外酶活性測(cè)定采用酶液瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行[5]?；痉椒ㄊ?在 GPP培養(yǎng)基中加入相應(yīng)底物,滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至 50℃左右后加入不同濃度的紅谷霉素 1 mL,搖勻倒平板,然后點(diǎn)滴稀釋好的菌體懸液 0.1 mL,涂布均勻,30℃培養(yǎng) 3 d,向培養(yǎng)皿中加入相應(yīng)酶的顯色劑顯現(xiàn)酶水解圈。據(jù)水解圈與菌落直徑的比值,了解各紅谷霉素濃度條件下菌株胞外酶的活性。

淀粉酶:底物為 0.25%可溶性淀粉,顯色劑為L(zhǎng)ugol’s碘液 (I21g,KI2g,H2O 300 mL)。

蛋白酶:底物為 1%明膠,顯色劑為飽和硫酸銨。

脂酶:底物為 1%的吐溫 20,不用顯色劑。

2 結(jié)果和分析

2.1 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌DNA的作用影響的測(cè)定結(jié)果

2.1.1 DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)表 1測(cè)定 DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果,如圖 1所示。

圖1 DNA標(biāo)曲Fig.1 Standard curve ofDNA

2.1.2 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌DNA的作用影響的測(cè)定結(jié)果

紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌 DNA的作用影響的測(cè)定結(jié)果,如圖 2所示。

圖2 金黃色葡萄球菌 DNA含量變化Fig.2 The change ofS.aureuDNA

從圖 2可以看出,在紅谷霉素對(duì)供試菌體的DNA有強(qiáng)烈地抑制作用。隨著紅谷霉素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)菌的 DNA含量在迅速地減少。

2.2 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌DNA的作用影響的測(cè)定結(jié)果

2.2.1 RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表 2測(cè)定 RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果,如圖 3所示。

圖3 RNA標(biāo)曲Fig.3 Standard curve of RNA

2.2.2 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌DNA的作用影響的測(cè)定結(jié)果

紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌 DNA的作用影響的測(cè)定結(jié)果,如圖 4所示。

圖4 金黃色葡萄球菌 RNA含量變化Fig.4 The change ofS.aureuRNA

從圖 4可以看出在紅谷霉素對(duì)供試菌體的RNA有強(qiáng)烈地抑制作用。隨著紅谷霉素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)菌的 RNA含量在迅速的減少。

2.3 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)的作用影響的測(cè)定結(jié)果

2.3.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表 3測(cè)定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果,如圖 5所示。

圖5 蛋白質(zhì)標(biāo)曲Fig.5 Standard curve of protein

2.3.2 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)的作用影響的測(cè)定結(jié)果

紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)的作用影響的測(cè)定結(jié)果,見(jiàn)圖 6所示。

圖6 金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)含量變化Fig.6 The change ofS.aureuprotein

從圖 6可以看出,紅谷霉素對(duì)供試菌體的蛋白質(zhì)有強(qiáng)烈地抑制作用。隨著紅谷霉素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)菌的蛋白質(zhì)含量在迅速的減少。

2.4 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌胞外多糖 (EPS)作用的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)紅谷霉素在 0、0.0025、0.005、0.01 mg/L和 0.02 mg/L五個(gè)濃度下對(duì)葡萄球菌作用 48 h后的相對(duì)粘度值 (每毫升上清液粘度/每毫克菌體干重),并將各相對(duì)粘度值與紅谷霉素濃度作圖,結(jié)果如圖 7所示。

圖7 紅谷霉素濃度與金葡菌菌體粘度關(guān)系Fig.7 The relate of Honggumycin chroma andS.aureuviscosi

從圖 7的結(jié)果可以看出,隨著紅谷霉素濃度的增加,金黃色葡萄球菌的胞外多糖含量相應(yīng)的減少,說(shuō)明紅谷霉素對(duì)細(xì)菌胞外多糖的產(chǎn)生會(huì)有抑制作用。

2.5 紅谷霉素對(duì)菌體細(xì)胞膜滲透性的作用的測(cè)定結(jié)果

加入紅谷霉素 EC50濃度作用于金黃色葡萄球菌,置于 30℃條件下培養(yǎng),分別在培養(yǎng) 0、3、6、12 h,取樣離心取上清液,用紫外分光光度計(jì)測(cè)吸收物含量變化,結(jié)果分別見(jiàn)圖 8～11。

從圖 8～11可以看出,經(jīng)紅谷霉素處理過(guò)的金黃色葡萄球菌隨處理時(shí)間的增加,吸光度越大,說(shuō)明胞外生物大分子含量增加。因此,可推斷紅谷霉素作用細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)合成,導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜上膜蛋白含量的減少,從而造成細(xì)胞膜通透性增加。

圖11 12 h吸光值測(cè)定Fig.11 The absorbance after handing 12 hours

2.6 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌作用前后體形態(tài)變化的測(cè)定結(jié)果

紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌作用前后菌體形態(tài)變化的透射電鏡照片見(jiàn)圖 12、13。

從圖 12、13的結(jié)果可以看出,用紅谷霉素處理后的細(xì)菌,其內(nèi)部原生質(zhì)體與對(duì)照相比明顯的變稀。紅谷霉素作用后菌體形態(tài)的變化進(jìn)一步說(shuō)明紅谷霉素對(duì)金黃葡萄球菌的抑菌機(jī)制是抑制菌體生物大分子 DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成。

2.7 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌胞外酶作用影響的測(cè)定結(jié)果

紅谷霉素處理前后金黃色葡萄球菌產(chǎn)胞外酶能力的比較結(jié)果如表 4所示:

表4 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的胞外酶產(chǎn)生的影響Table 4 The activity of extracellullar enzymes ofS.aureu

從表 4可以看出,在培養(yǎng)基中加入紅谷霉素后,細(xì)菌的胞外淀粉酶、蛋白酶和脂酶產(chǎn)量有明顯的降低,這進(jìn)一步說(shuō)明紅谷霉素對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成有強(qiáng)烈的抑制作用。

3 討論

3.1 紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的 DNA、RNA、蛋白質(zhì)、胞外多糖和胞外淀粉酶、蛋白酶、脂酶的合成有強(qiáng)烈地抑制作用。隨著紅谷霉素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)菌的 DNA、RNA、蛋白質(zhì)、胞外多糖和胞外淀粉酶、蛋白酶、脂酶含量在迅速地減少。說(shuō)明紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的作用機(jī)制是首先抑制細(xì)胞內(nèi) DNA、RNA的合成,從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)的減少和細(xì)胞膜的滲透性增大。

3.2 紅谷霉素處理前后金黃色葡萄球菌菌體形態(tài)的透射電鏡照片表現(xiàn)出明顯的變化,這從菌體的形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步佐證了紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的作用機(jī)制。

3.3 在以紅谷霉素為試驗(yàn)材料,分別以 G+菌,臘質(zhì)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和 G-菌,大腸桿菌和小麥青枯病為供試菌進(jìn)行抑制機(jī)制的研究,獲得了與金黃色葡萄球菌同樣的試驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)一步說(shuō)明紅谷霉素對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制是抑制細(xì)菌細(xì)胞內(nèi) DNA和RNA的合成,從而導(dǎo)致影響細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)的合成。本試驗(yàn)獲得的紅谷霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的作用機(jī)制有待于分子生物學(xué)上進(jìn)一步試驗(yàn)和驗(yàn)證。

1 Li KT,Li XH,Liu SH,et al.A prel iminary study on the effects of bio-antiseptic 702 on anti-bacteria,anti-moulds and anti-yeasts.Acta Agric Univ Jiangxiensis,2002,24:599-602.

2 Cai HJ,Wen Y,Tu GQ.Measure of the stability of the bioactive compound produced byStreptom yces702.Acta AgricUniv Jiangxiensis,2003,25:929-933.

3 Shen P,Fan XR,Li G W,et al.Microbiology Experments.Beijing:Higher Education Press,1999,18:214-223.

4 Huang YL,Hu ML. Improvement on cell membrane permeability experiment.J Zhanjiang No rm al Coll,2005,26:119-122.

5 Dingle J,RE ID WW,Solomons GL.The enzymic de gradation of pection and otherpolysaccharides.J Sci Food Agric,1953,4:149-155.

Antibacterial Mechanism of Honggumycin toStaphylococcus aureus

TU Xuan,XUE Xiu-yuan,TU Guo-quan＊
B iological Science&Engineering College,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China

Q939;R446.5

A

1001-6880(2011)01-0153-06

2009-09-04 接受日期:2009-11-30

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(0630013)

＊通訊作者 E-mail:tuguoquan@263.net