冮 潔，金京慧

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600)

真姬菇菌絲體液體發(fā)酵富鋅條件的優(yōu)化

冮 潔，金京慧

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600)

通過液體發(fā)酵技術(shù)對(duì)真姬菇菌絲體富鋅條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:真姬菇菌絲體具有較強(qiáng)的耐鋅能力和富鋅能力，在300～700mg/L的鋅濃度范圍內(nèi)都可以生長(zhǎng)。菌絲體對(duì)鋅的最適富集濃度為400mg/L，并且對(duì)富集的鋅有機(jī)化程度較高。真姬菇菌絲體最優(yōu)富鋅條件為:在發(fā)酵溫度28℃，起始pH 6，振蕩轉(zhuǎn)速150r/min，250mL三角瓶裝液50mL，接種量5%(V∶V)時(shí)培養(yǎng)6d，真姬菇菌絲體富鋅率為最高，可達(dá)7.98%，且該組的有機(jī)鋅的富集率為4.90%。

真姬菇，富集鋅，液體發(fā)酵，菌絲體

真姬菇(Hypsizigus marmorens)又名玉蕈、斑玉蕈、蟹味菇等，是一種珍稀食用菌。它隸屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，白蘑科，玉蕈屬。自然分布于歐洲、北美、西伯利亞和日本等地［1］。采用液體深層發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)真姬菇菌絲體，不受環(huán)境因素的影響，易控制，效率高，價(jià)格便宜，適合工業(yè)化生產(chǎn)。并且深層發(fā)酵培養(yǎng)的真菌菌絲體與子實(shí)體在化學(xué)組成、生理功能上均很相似［2－3］。鋅是人體必需的微量元素之一，是許多金屬酶的組成成分或酶的激活劑。鋅缺乏在中國(guó)人群中普遍存在，嬰兒、兒童、孕婦和育齡婦女缺鋅尤其嚴(yán)重［4］。食品中以游離態(tài)存在的鋅不易被人體吸收，且一般游離態(tài)的金屬均具有一定毒性。因?yàn)楦讳\食用菌中的鋅較無機(jī)鋅更安全無毒且利用率高，所以多用于制造補(bǔ)鋅的藥物與產(chǎn)品，如口服液、藥片等。也有創(chuàng)新產(chǎn)品的研制，如富鋅靈芝枇杷保健冰激凌［5］。富鋅食用菌的產(chǎn)品無論從種類還是數(shù)量上都很少，還處于起步階段。劉坤等對(duì)姬松茸菌絲進(jìn)行了富集鋅的研究［6］。鄧百萬等進(jìn)行了豬苓菌絲液體培養(yǎng)及富鋅研究，在液體深層培養(yǎng)基中加入無機(jī)鋅鹽，豬苓有顯著吸附作用并形成有機(jī)鋅［7］。張琪林等對(duì)大球蓋菇富鋅特性進(jìn)行了研究，得出培養(yǎng)基中硫酸鋅的添加量應(yīng)以385mg/kg為宜，在此濃度，菌絲鋅含量可達(dá)24.243mg/kg，雖然不是很高，但都是有機(jī)鋅，有利于人體吸收［8］。本文對(duì)真姬菇菌絲體富鋅能力進(jìn)行了考察，并對(duì)其液體發(fā)酵富鋅的適宜條件進(jìn)行了優(yōu)化，為真姬菇菌絲體的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

真姬菇(Hypsizigus marmoreus) 購自朝陽市食用菌研究所;斜面和固體平板培養(yǎng)基(綜合PDA培養(yǎng)基) 馬鈴薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀1.5g、硫酸鎂1.0g、瓊脂粉20g、水1000mL，自然pH;液體培養(yǎng)基 不加瓊脂的綜合PDA培養(yǎng)基;葡萄糖、瓊脂粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鋅 以上試劑均為分析純或化學(xué)純。

電子精密天平，電熱恒溫培養(yǎng)箱，無菌操作臺(tái)，紫外可見分光光度計(jì)，恒低溫氣浴搖床，pH酸度計(jì)，智能水分測(cè)定儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將保存菌種用接種針接入斜面培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)10d。

1.2.2 菌絲體培養(yǎng)

1.2.2.1 液體菌種培養(yǎng) 將活化的菌種接種在裝有100mL不加瓊脂的液體PDA綜合培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，接種量為10%，置28℃，150r/min恒溫振蕩培養(yǎng)10d。

1.2.2.2 富鋅發(fā)酵培養(yǎng) 將液體菌種接入裝100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量為10%，分別加入終濃度為0、300、400、500、600、700、800mg/L的ZnSO4母液，28℃，150r/min振蕩培養(yǎng)10d。

1.2.3 菌絲體鋅含量的測(cè)定 采用雙硫腙分光光度法測(cè)定［9］。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。

1.2.4 菌絲體生物量的測(cè)定 取10mL發(fā)酵液于5000r/min離心20min，蒸餾水洗滌3次，60℃烘至恒重，分析天平稱重。

1.2.5 菌絲體富鋅有機(jī)化程度的分析 在液體培養(yǎng)富鋅能力的實(shí)驗(yàn)樣品中，抽取硫酸鋅濃度為400mg/L與500mg/L的樣品檢測(cè)有機(jī)化程度。將菌絲體放入去離子水中不斷離心洗滌直至上清液澄清，檢測(cè)上清液與菌絲體中的含鋅量。

1.2.6 富鋅率的計(jì)算

富鋅率(%)=［富鋅菌絲體含量(μg/g)－空白菌絲體鋅含量(μg/g)］×富鋅菌絲體干重(g/100mL)/培養(yǎng)基內(nèi)鋅含量(μg/100mL)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 真姬菇菌絲體固體培養(yǎng)耐鋅能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將真姬菇接種到含不同濃度鋅的固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，考察菌絲生長(zhǎng)情況。

結(jié)果如圖1所示，通過測(cè)定菌落直徑可以看出，鋅濃度為300～400mg/L時(shí)有明顯的促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)的作用;當(dāng)鋅濃度大于700mg/L時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)下降。通過測(cè)定菌絲萌發(fā)時(shí)間可以看出，鋅濃度為400～600mg/L時(shí)，菌絲萌發(fā)需要時(shí)間較短，鋅的添加有促進(jìn)菌絲萌發(fā)的作用。

圖1 真姬菇菌絲體固體培養(yǎng)耐鋅能力實(shí)驗(yàn)

2.2 真姬菇液體培養(yǎng)耐鋅能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)耐鋅平板培養(yǎng)的結(jié)果，設(shè)定真姬菇耐鋅濃度在0～800mg/L，分別配制硫酸鋅濃度為0、300、400、500、600、700、800mg/L的液體培養(yǎng)基，進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)10d，測(cè)定菌絲體含鋅量，結(jié)果見表1。

表1 真姬菇液體培養(yǎng)耐鋅能力實(shí)驗(yàn)

從表1可以看出，當(dāng)鋅濃度為400mg/L時(shí)，對(duì)菌絲體生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，高于400mg/L則起到抑制作用，當(dāng)鋅濃度為800mg/L時(shí)，菌絲體幾乎沒有生長(zhǎng)。菌絲體含鋅量的最高值出現(xiàn)在鋅濃度為500mg/L時(shí)，富鋅率的最高值出現(xiàn)于400mg/L。分別選擇鋅濃度為400mg/L和500mg/L培養(yǎng)的菌絲體做鋅有機(jī)化程度實(shí)驗(yàn)。

2.3 富鋅有機(jī)化程度的比較與分析

除去菌絲體上粘附的培養(yǎng)基中的ZnSO4和菌絲體中的無機(jī)鋅，測(cè)定有機(jī)鋅的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 真姬菇菌絲體富鋅有機(jī)化程度的比較

從表2可以看出，雖然鋅濃度為400mg/L的菌絲體的富鋅率最高，但是500mg/L的真姬菇菌絲體的有機(jī)化程度要比鋅濃度400mg/L真姬菇菌絲體的有機(jī)化高。培養(yǎng)基中的無機(jī)鋅是通過與菌絲體中的蛋白質(zhì)、多糖等大分子結(jié)合而形成有機(jī)鋅的。當(dāng)鋅濃度是400mg/L時(shí)真姬菇菌絲體有機(jī)鋅的富集率高于鋅濃度是500mg/L時(shí)有機(jī)鋅的富集率。因此，選擇400mg/L作為下一步實(shí)驗(yàn)鋅添加濃度。

2.4 真姬菇液體發(fā)酵富鋅條件的優(yōu)化

采用四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，研究裝液量、接種量、pH、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)真姬菇富鋅的影響。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

由表4可知，以富鋅率為目標(biāo)值的實(shí)驗(yàn)因素影響的主次順序?yàn)?A(裝液量)>B(接種量)>D(培養(yǎng)時(shí)間)>C(pH)。最優(yōu)組合為:A1B1C1D1，即裝液量50mL、接種量5%、pH6、培養(yǎng)時(shí)間6d，是正交實(shí)驗(yàn)表中第1組實(shí)驗(yàn)，富鋅率最大，為7.98%，其中該組別的有機(jī)鋅的富集率為4.90%。

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表5)可知，因素A(裝液量)對(duì)真姬菇菌絲體富鋅的影響具有顯著性。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表

3 結(jié)論

通過液體發(fā)酵技術(shù)對(duì)真姬菇菌絲體進(jìn)行富鋅，結(jié)果表明:真姬菇菌絲體具有較強(qiáng)的耐鋅能力和富鋅能力，在300～700mg/L的鋅濃度范圍內(nèi)都可以生長(zhǎng)。菌絲體對(duì)鋅的最適富集濃度為400mg/L，并且對(duì)富集的鋅有機(jī)化程度較高，最大富鋅率可達(dá)7.98%，該組的有機(jī)鋅的富集率為4.90%。

本文采用ZnSO4作為真姬菇富鋅的鋅源，不同的鋅源對(duì)食用菌菌絲體富鋅會(huì)產(chǎn)生不同的影響。根據(jù)黃仁術(shù)等人的研究結(jié)果液體培養(yǎng)金針菇富鋅Zn(CH3COO)2作為鋅源要比ZnSO4、ZnCl2利用率高。因?yàn)閆n(CH3COO)2是弱酸弱堿鹽，它可以使菌絲與鋅在適宜的、穩(wěn)定的環(huán)境中絡(luò)合和生長(zhǎng)［10］。培養(yǎng)基中的無機(jī)鋅是通過與菌絲體中的蛋白質(zhì)、多糖等大分子結(jié)合而形成有機(jī)鋅的。

［1］張俊剛.真姬菇功能食品抗疲勞研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(19):8141－8142.

［2］李娟，王臻，姚良同，等.真姬菇多糖研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)雜志，2005，25(4):89－91.

［3］鄧超，鄔敏辰.食用菌深層發(fā)酵及其多糖活性研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(15):4622－4625.

［4］秦義.富鋅靈芝液體種子培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16(1):153－156.

［5］張紅兵.富鋅靈芝枇杷保健冰激凌的研制［J］.冷飲與速凍食品工業(yè)，2006，12(2):13－18.

［6］劉坤，沈衛(wèi)，章克昌.姬松茸深層發(fā)酵富集鋅的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(4):84－86.

［7］鄧百萬，陳文強(qiáng).豬苓菌絲液體培養(yǎng)及富鋅研究［J］.中國(guó)食用菌，2002(22):33－34.

［8］張琪林，王紅.大球蓋菇液體培養(yǎng)富鋅特性研究［J］.農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2007，27(5):58－59.

［9］無錫輕工業(yè)大學(xué)，天津輕工業(yè)學(xué)院.食品分析［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005:313－318.

［10］黃仁術(shù).液體培養(yǎng)富鋅金針菇鋅源與鋅添加量的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(12):48－51.

Optimization of mycelium liquid fermentation conditions of Zinc－riching of Hypsizigus marmoreus

GANG Jie，JIN Jing－h(huán)ui(
College of Life Sciences，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China)

The mycelium liquid fermentation conditions of Zinc－riching of Hypsizigus marmoreus were studied.The results showed that Hypsizigus marmoreus mycelium had the capacities of Zn－resisting and Zn－accumulating.The strain could grow in the medium with Zinc concentration from 300mg/L to 700mg/L.When Zinc added to the liquid medium was 400mg/L，the mycelium had the most Zinc absorbance and better Zinc organic.The optimum Zincriching liquid fermentation conditions were as following:fermentation temperature 28℃，pH 6，stirring speed 150r/min，250mL shake flash containing 50mL，inoculation size 5%(V∶V)for 6d.Under the conditions，the ratio of Zn－accumulation reached a maximum of 7.98%，the degree of this group Zinc organic was 4.90%.

Hypsizigus marmoreus;Zinc－riching;liquid fermentation;mycelium

TS201.3

A

1002－0306(2011)06－0226－03

2010－07－07

冮潔(1965－)，女，博士，研究方向:食品生物技術(shù)。

大連民族學(xué)院自主基金(財(cái)政專項(xiàng)－中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi))項(xiàng)目(DC10020106)。