張 強(qiáng)，王松華，孫玉軍，馬玉涵，史芳芹

(安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽蚌埠233100)

米糠白酶角物鋅螯合物的制備工藝

張 強(qiáng)，王松華，孫玉軍，馬玉涵，史芳芹

(安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽蚌埠233100)

研究了米糠蛋白酶解物鋅螯合物的制備工藝。通過單因素實(shí)驗(yàn)分析了米糠蛋白酶解物的制備方法、米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比和pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響，在此基礎(chǔ)上利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化螯合物的制備工藝。結(jié)果表明，米糠蛋白酶解物鋅螯合物的最佳制備工藝為:米糠蛋白酶解物的制備方法為胃蛋白酶結(jié)合中性蛋白酶法，米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比2∶1，pH 8.0，此條件下螯合物得率和螯合率分別為94.93%和94.85%。

米糠，鋅，酶解，螯合物

鋅是細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖所必需的微量元素，是許多金屬酶的組成成分或一些酶的激活劑，在兒童生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用。盡管自然界中鋅源十分豐富，但鋅在人體內(nèi)的吸收代謝受種種因素的限制，鋅缺乏已成為我國(guó)及許多發(fā)展中國(guó)家亟待解決的公共衛(wèi)生問題［1］。目前的補(bǔ)鋅制劑主要有無機(jī)鋅、有機(jī)鋅和氨基酸螯合鋅。前兩類存在穩(wěn)定性差、受腸道內(nèi)容物影響大及吸收率低等缺點(diǎn)。第三類與前兩類產(chǎn)品相比，具有穩(wěn)定性好、抗干擾力強(qiáng)、易吸收和生物利用率高等優(yōu)點(diǎn)，并具有補(bǔ)充微量元素和氨基酸的雙重作用，但由于價(jià)格較高，限制了其在生產(chǎn)上的應(yīng)用。早在20世紀(jì)70年代，就有研究者發(fā)現(xiàn)氨基酸和小肽具有促進(jìn)鋅吸收的作用，而且氨基酸或肽的金屬?gòu)?fù)合體如Fe、Zn和Cr的生物學(xué)利用率比無機(jī)鹽高，無毒副作用［2］，因此，研究開發(fā)這種生物態(tài)鋅——蛋白酶解物螯合鋅，具有十分重要的意義。目前，大豆蛋白、絲素蛋白、酪蛋白等諸多蛋白酶解物與鋅的螯合條件及其螯合物的生物活性方面已受到普遍關(guān)注［3－6］，但對(duì)米糠蛋白酶解物鋅螯合物的制備工藝的研究尚未見報(bào)道。米糠是糙米碾白過程中被碾下的皮層及少量米胚和碎米的混合物，是一種廉價(jià)、低利用率但營(yíng)養(yǎng)豐富的稻米加工副產(chǎn)品［7］，聯(lián)合國(guó)工業(yè)發(fā)展組織把米糠稱為一種未充分利用的原料［8］。因此，本文以米糠為原料，研究其酶解物與鋅的螯合工藝，以促進(jìn)米糠深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，增加農(nóng)民收入，同時(shí)也為生物態(tài)鋅的研究開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供有益的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂米糠蛋白 實(shí)驗(yàn)室自制;胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HH－4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;Phs－3C型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SHB－B95型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;101AS－3型數(shù)顯恒溫干燥箱 上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠;756MC紫外可見分光光度計(jì) 上海精科公司分析儀器總廠。

表1 米糠蛋白酶解物的制備

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米糠蛋白酶解物的制備 質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的米糠蛋白懸浮液于90℃恒溫水浴鍋中熱變性處理15m in，冷卻后按表1的六種方法水解米糠蛋白(期間用1mol/L的HCl或NaOH維持pH恒定)，反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴5m in滅酶活，12000 r/m in離心10m in，上清液冷凍干燥，即為米糠蛋白酶解物。

1.2.2 螯合物的制備 米糠蛋白酶解物溶液與氯化鋅溶液按一定比例混合→調(diào)pH→50℃恒溫水浴1h→4000r/min離心20min→沉淀95%乙醇洗滌抽濾→沉淀用少量乙醚洗滌抽濾→80℃熱風(fēng)干燥→螯合物

1.2.3 螯合物得率和螯合率 鋅含量按GB8820－1988測(cè)定。米糠蛋白酶解物螯合鋅鹽的能力和效果用螯合率和螯合物得率表示，其計(jì)算公式為:

螯合物得率(%)=W/W0×100%

式中:W0:米糠蛋白酶解物與鋅的質(zhì)量和(g);W:米糠蛋白酶解物鋅螯合物質(zhì)量(g)

螯合率(%)=W/W0×100%

式中:W0:反應(yīng)體系中鋅的質(zhì)量(g);W:螯合物中鋅的質(zhì)量(g)

1.2.4 鰲合物制備條件的優(yōu)化

1.2.4.1 鰲合物制備的單因素實(shí)驗(yàn) 以鰲合物得率和鰲合率為指標(biāo)分別考察米糠蛋白酶解物的制備方法、pH、米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比三個(gè)因素對(duì)鰲合物制備的影響，其中制備方法六種(表1)，pH設(shè)定五個(gè)梯度(2、4、6、8、10)，米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比設(shè)定五個(gè)梯度(2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1)。

1.2.4.2 鰲合物制備的正交實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)中，每組實(shí)驗(yàn)只考察一個(gè)因素，而螯合反應(yīng)的最佳條件并不是簡(jiǎn)單地將所有這些單因素實(shí)驗(yàn)的最佳結(jié)果疊加在一起，還必須通過正交實(shí)驗(yàn)考察多因素的疊加效果，故基于以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9(33)正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，各因素水平的設(shè)定如表2所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表

1.2.5 螯合物的鑒定［9］由于金屬硫化物的穩(wěn)定常數(shù)遠(yuǎn)大于螯合物的穩(wěn)定常數(shù)，當(dāng)加入硫化鈉時(shí)，S2－與螯合物中的金屬離子反應(yīng)，生成了更穩(wěn)定的金屬硫化物沉淀，從而使螯合物中的氨基酸或小肽游離出來?？梢岳抿衔镞@一特有的性質(zhì)來對(duì)樣品進(jìn)行定性鑒定。

取純化后的螯合物0.5g，先用少量鹽酸溶解，再加20m L蒸餾水和幾滴茚三酮指示劑，煮沸3～5m in，觀察顏色變化。另取純化后的螯合物0.5g，先用少量鹽酸溶解，再20m L蒸餾水，再加入過量的固體硫化鈉，攪拌，靜置，出現(xiàn)白色沉淀。過濾，濾液加幾滴茚三酮指示劑，煮沸3～5m in，觀察顏色變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 米糠蛋白酶解物制備方法對(duì)螯合反應(yīng)的影響

不同的米糠蛋白酶解物由于制備時(shí)采用的蛋白酶不同，米糠蛋白的水解度不同，得到的米糠蛋白酶解物也就存在較大差異，這直接會(huì)影響到螯合物得率和螯合率。在米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比為4∶1，pH5.0條件下，米糠蛋白酶解物的制備方法對(duì)螯合反應(yīng)的影響如圖1所示。從圖1可以看出，米糠蛋白酶解物的制備方法對(duì)螯合反應(yīng)影響較明顯，其中胰蛋白酶結(jié)合胃蛋白酶法的鰲合物得率和鰲合率最高。

圖1 米糠蛋白酶解物制備方法對(duì)螯合反應(yīng)的影響注:圖中數(shù)字對(duì)應(yīng)的方法見表1。

2.1.2 pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響 pH是螯合物制備的重要影響因素。在pH較低的酸性條件下，H+將與金屬離子Zn2+競(jìng)爭(zhēng)供電子基團(tuán)，不利于螯合物的生成;在pH較高的堿性條件下，OH－與供電子基團(tuán)爭(zhēng)奪金屬離子Zn2+而易形成氫氧化鋅沉淀。用胰蛋白酶結(jié)合胃蛋白酶法制備的米糠蛋白酶解物與Zn2+螯合，米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比為4∶1，此條件下pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著pH的升高，螯合物得率與螯合率逐漸增大，當(dāng)pH為8.0時(shí)，螯合物得率與螯合率均達(dá)到最大，再增加pH，螯合物得率與螯合率開始下降。

2.1.3 米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)的影響 米糠蛋白酶解物與鋅的質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)的影響很大。若比值過大，米糠蛋白酶解物的利用率下降，造成原料浪費(fèi);比值過小，螯合反應(yīng)不顯著，生成的螯合物不穩(wěn)定。用胰蛋白酶結(jié)合胃蛋白酶法制備的米糠蛋白酶解物與Zn2+螯合，pH8.0，此條件下米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)的影響如圖3所示。

由圖3可知，對(duì)螯合物得率而言，米糠蛋白酶解物與鋅的質(zhì)量比為2∶1時(shí)，螯合物得率最大，再增大米糠蛋白酶解物與鋅的質(zhì)量比，螯合物得率明顯下降;對(duì)螯合率而言，米糠蛋白酶解物與鋅的質(zhì)量比為2∶1和4∶1時(shí)均有較大的螯合率，再增大質(zhì)量比，螯合率變化不明顯。

圖2 pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響

圖3 米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。極差大小可反映各因素對(duì)指標(biāo)影響的程度。由表3的極差分析可看出，影響螯合物得率和螯合率的所選因素的主次順序均為B>C>A，即米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比>pH>米糠蛋白酶解物的制備方法;最佳的螯合工藝條件為A1B1C1，即米糠蛋白酶解物的制備方法為胃蛋白酶結(jié)合中性蛋白酶法，米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比為2∶1，pH 8.0，此條件下螯合物得率和螯合率均最大，分別為94.93%和94.85%。

2.3 螯合物的鑒定結(jié)果

未加硫化鈉的螯合物樣品水溶液，用茚三酮試劑檢測(cè)，溶液顏色沒有發(fā)生改變;加入過量的硫化鈉后得到的濾液，用茚三酮試劑檢測(cè)，溶液變?yōu)樽霞t色，即原樣品溶液中沒有游離的氨基酸或小肽，加入過量的硫化鈉生成了ZnS沉淀以后，有了游離的氨基酸或小肽。這說明待測(cè)物質(zhì)是米糠蛋白酶解物和鋅離子形成的一種特殊物質(zhì)，這種物質(zhì)就是米糠蛋白酶解物與鋅的螯合物。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)條件下米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比是影響螯合反應(yīng)的最主要因素，最佳的螯合工藝條件為:米糠蛋白酶解物的制備方法胃蛋白酶結(jié)合中性蛋白酶法，米糠蛋白酶解物與鋅質(zhì)量比2∶1，pH 8.0，此條件下螯合物得率和螯合率分別為94.93%和94.85%。

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［2］喬偉，周安國(guó)，王之盛，等.小肽促進(jìn)微量元素吸收的研究進(jìn)展［J］.飼料工業(yè)，2006，27(17):12－14.

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Study on preparation technology of rice bran protein hydrolysate chelated w ith zinc

ZHANG Qiang，WANG Song－h(huán)ua，SUN Yu－jun，MA Yu－h(huán)an，SHIFang－qin
(Life Science College，Anhui Science and Technology University，Bengbu 233100，China)

Chelation process of rice bran protein hydrolyses w ith the zinc was studied.Three main factors including preparation methods of the rice bran protein hydrolysate，mass ratio of rice bran protein hydrolysate to zinc and pH were investigated by using single factor analysismethod.On this basis，the optimal chelation technology was obtained by orthogonal experim ent.The experim ental results showed that the best technical conditions for preparation of chelate were as follows:pepsin combined w ith neutral protease was used for preparation of rice bran hydrolysate，m ass ratio of rice bran protein hydrolysate to zinc was 2 to 1，pH 8.0，under this conditions the yield rates and chelate ratio was 94.93%and 94.85%respectively.

rice bran;zinc;hydrolysis;chelate

TS210.1

B

1002－0306(2011)06－0281－03

2010－06－04

張強(qiáng)(1979－)，男，碩士，講師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工方面的研究。

安徽省高校青年科研資助計(jì)劃項(xiàng)目資助(2006jql197);安徽科技學(xué)院生物學(xué)校級(jí)重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目資助(AKXK20102－1)。