宋廣磊，杜琪珍

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310035）

逆流色譜和超濾分級(jí)法分離海帶多糖的研究

宋廣磊，杜琪珍

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310035）

研究了逆流色譜分離海帶多糖，超濾法對(duì)分離的多糖進(jìn)行純化的方法，取得了較好效果。采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法篩選出了逆流色譜分離海帶多糖的溶劑系統(tǒng)為：12%PEG1000，8%KH2PO4和8%K2HPO4，轉(zhuǎn)速為400r/min。利用此參數(shù)條件從海帶多糖中分離得到兩種多糖KPS－1和KPS－2，純度分別為87.5%和89.6%。對(duì)分離后的海帶多糖組分KPS－1和KPS－2進(jìn)行超濾純化分級(jí)，從KPS－1中獲得了KPS－1－1和KPS－1－2兩種多糖；從KPS－2中獲得了KPS－2－1和KPS－2－2兩種多糖。HPLC分析結(jié)果表明，超濾分級(jí)可使海帶多糖組分KPS－1和KPS－2達(dá)到純化目的，效果較好。

逆流色譜，溶劑系統(tǒng)，超濾，多糖

逆流色譜（Countercurrent chromatography，CCC）技術(shù)是一種無固體載體的連續(xù)液－液分配色譜技術(shù)，其固定相通過重力場(chǎng)和離心力場(chǎng)作用被保留在分離柱內(nèi)，流動(dòng)相與固定相在色譜儀內(nèi)進(jìn)行分配，而達(dá)到物質(zhì)的分離［1－3］。逆流色譜與傳統(tǒng)色譜相比具有無死吸附、進(jìn)樣量大、分離純度高等顯著的優(yōu)勢(shì)，在食品、生物化工、制藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。多糖是生命物質(zhì)的組成成分之一，大量藥理及臨床研究證實(shí)：多糖有調(diào)節(jié)免疫［4－5］、抗癌［6－7］、抗炎［8］、提高上皮細(xì)胞活性［9］以及促進(jìn)傷口愈合［10］等生理功能，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品及功能食品。海帶多糖具有抗腫瘤、抗高血脂、降血糖等各種生物活性。利用逆流色譜分離和超濾分級(jí)的方法分離純化海帶多糖的研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶多糖 購于陜西西安小草植物有限公司；PEG1000、K2HPO4、KH2PO4、鉬酸鈉、濃硫酸、濃硝酸、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、氨水、葡萄糖、檸檬酸、喹啉、苯酚、三氯乙酸等 均為分析純，購自杭州華東化學(xué)試劑有限公司；液相色譜所用水 娃哈哈純凈水；TLC板 20×20cm Sillca gel 60 F254，德國Merck；濾膜 0.45!m，Automatic Science Instrument Co.，LTD.。

3K3 0臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國 SIGMA；VIS－723G型可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；LC－10A液相色譜儀 日本 SHIMADZU；SEDEX75蒸發(fā)光檢測(cè)器 法國 SEDEX；ZJGSUD400X制備型高速逆流色譜儀 浙江工商大學(xué)食品與生物工程研究所研制；Preparative HPLC Pump K－1800恒流泵 德國KNAUER；B－684自動(dòng)部分收集器 瑞士 BüCHI；minifilter－200超濾儀 美國PALL；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、B－220恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；SHZ－D－!循環(huán)水式真空泵 河南鞏義市英峪豫華儀器廠；DLSB低溫冷卻液循環(huán)泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；FD－1冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康技術(shù)公司；KQ5200E超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司；GZX－9240MBE鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海帶多糖的精制 海帶多糖，加入10倍60℃

熱蒸餾水溶解。冷卻后4000r/min離心10min除去不溶物。所得溶液用70℃減壓濃縮至體積的1/5，放冷，5000r/min離心10min，上清液繼續(xù)濃縮至呈稠膏狀，加入4倍體積無水乙醇，邊加邊攪拌，靜置過夜后4000r/min離心10min，傾去上清液，余下部分加5倍量的2%三氯乙酸除蛋白，4000r/min離心10min，取上清液進(jìn)行紫外掃描（200～400nm），若無紫外吸收說明無蛋白，若有紫外吸收則繼續(xù)脫蛋白，直至無紫外吸收，然后溶液用5倍量無水乙醇沉淀，沉淀冷凍干燥，得精制海帶多糖［11－13］。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定 采用苯酚－硫酸法測(cè)定多糖含量［14－15］。其原理是糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，

且在485nm波長(zhǎng)下有最大吸收峰。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測(cè)定，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)時(shí)基本不受蛋白質(zhì)存在的影響。

1.2.3 逆流色譜溶劑系統(tǒng)的選擇 逆流色譜（CCC）的組成見圖1。

圖1 逆流色譜儀系統(tǒng)

溶劑系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)逆流色譜分離的關(guān)鍵。溶劑系統(tǒng)配制后充分混合均勻，靜止分層。以上層為固定相，下層為流動(dòng)相。用泵把固定相從進(jìn)口注入HSCCC分離柱中，待固定相充滿后，開動(dòng)主機(jī)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速達(dá)到預(yù)定轉(zhuǎn)速并穩(wěn)定后，用20mL固定相溶解0.15g精制多糖，用恒流泵將樣品溶液以一定流速注入HSCCC，部分收集器收集。分離完成后，停止轉(zhuǎn)動(dòng)。用氣泵使HSCCC中的液體流出。苯酚－硫酸法測(cè)定多糖在上下相中的濃度，計(jì)算固定相分配系數(shù)（K），根據(jù)上下相的體積計(jì)算保留率（SF）［16－17］。采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法（因素水平編碼表見表1），設(shè)計(jì)了36種不同的分離條件（見表2），根據(jù)分離情況篩選最佳條件作為實(shí)驗(yàn)分離的條件。

表1 實(shí)驗(yàn)因素和水平編碼對(duì)照表

1.2.4 TLC檢測(cè)方法 將TLC薄板切割成10cm×5cm的大小，在距離薄板底部0.5cm劃一橫線，橫線上每隔0.5cm點(diǎn)樣，用0.5mm毛細(xì)管點(diǎn)樣一次，配制正丁醇∶乙醇∶水=5∶3∶2，放于4℃冰箱中，展開時(shí)取下層4mL放于展缸，同時(shí)加0.05mL濃氨水，混勻，進(jìn)行展開。乙醇∶濃硫酸=1∶9的溶液為顯色劑，120℃電爐上顯色［18］。

1.2.5 超濾分級(jí)純化方法［19－21］收集逆流色譜分離的多糖組分用半透膜進(jìn)行脫鹽、脫P(yáng)EG。半透膜采用截留分子量8000～14000Da的透析，流水透析3晝夜，喹鉬檸酮法測(cè)定無磷酸根離子存在時(shí)即停止透析。

為防止雜質(zhì)污染超濾膜，導(dǎo)致超濾濃縮效率下降，超濾前將透析后的組分用0.45"m濾膜過濾，以降低對(duì)膜的污染。超濾膜采用透過分子量為30×103Da和50×103Da的濾膜進(jìn)行超濾。

超濾時(shí)先將待過濾液裝入量杯，泵流速20mL/min，壓力1.5MPa，過濾前后分別測(cè)定多糖濃度，比較多糖的損失情況，結(jié)果見表3。處理過程流程圖見圖2。

圖2 逆流色譜和超濾分級(jí)流程圖

1.2.6 HPLC法檢測(cè)多糖純度［22－24］用HPLC法測(cè)定多糖的分離效果。島津LC－10A液相色譜儀，檢測(cè)器為SEDEX75蒸發(fā)光檢測(cè)器，色譜柱為Shodex TSK G－5000 PWxl凝膠柱（5m，300mm×1.5mm I.D.，Kyoto，Japan），流動(dòng)相為純凈水，流速0.8mL/min，柱溫為35℃，漂移管溫度為80℃，壓力3.5bar，進(jìn)樣量10"L。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶多糖精制得率

在精制過程中發(fā)現(xiàn)海帶粗多糖中有少量雜質(zhì)和不溶物，這些雜質(zhì)和不溶物在離心和溶解過程中都可除去。用2%三氯乙酸進(jìn)行脫蛋白時(shí)，在溶液底部發(fā)現(xiàn)有少量沉淀，可知海帶多糖中含有少量蛋白。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)海帶中的蛋白一般用2%三氯乙酸作用一晝夜就可除去。海帶多糖49.3626g經(jīng)精制后得精制多糖33.4261g，得率67.71%，純度56.02%。

表2 逆流色譜分離系統(tǒng)四因素五水平中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2 逆流色譜分離條件

逆流色譜分離的效果主要取決于樣品在固定相與流動(dòng)相之間的分配系數(shù)K和固定相保留率SF。其中后者又主要受溶劑系統(tǒng)分層時(shí)間以及逆流色譜儀轉(zhuǎn)速、流動(dòng)相流速、實(shí)驗(yàn)溫度等逆流色譜參數(shù)的影響。因此，在溶劑系統(tǒng)既定的情況下，選擇適宜的逆流色譜工藝參數(shù)至關(guān)重要。

一般來說，保留率SF隨轉(zhuǎn)速增加而不斷上升，但同時(shí)也需要考慮儀器的穩(wěn)定性，因此在儀器所能承受的限度內(nèi)盡量選擇較大轉(zhuǎn)速。而隨流速的增大，保留率SF不斷下降，但是流速過低會(huì)導(dǎo)致分離時(shí)間過長(zhǎng)，分離效率降低［17］。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)中采用400r/min的轉(zhuǎn)速和1.0mL/min的流速。在不同的逆流系統(tǒng)條件下，各溶劑系統(tǒng)的情況見表2。

2.3 逆流色譜分離結(jié)果

各分離系統(tǒng)的分離情況用TLC檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)比較采用系統(tǒng)18的分離效果較好，見圖3。在 PEG1000含量為 12%，K2HPO4含量為 8%，KH2PO4含量為8%時(shí)，可使海帶多糖達(dá)到分離。

圖3 逆流色譜分離海帶多糖TLC圖譜

收集17～41管組分和51～65管組分，并分別命名為KPS－1和KPS－2。將獲得的組分KPS－1和KPS－2用8000～14000Da透析袋進(jìn)行連續(xù)透析72h、減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得海帶多糖組分KPS－1 64.1mg和KPS－2 52.7mg。各精確稱5mg KPS－1和

定量至50mL，苯酚－硫酸法測(cè)定多糖含量。測(cè)得KSP－1和KSP－2含量分別為87.5%和89.6%，純度有了很大提高。HPLC圖見圖4、圖5。由圖4、圖5可看出，HPLC圖譜頂端有峰未分開，推測(cè)可能有相似的多糖組分未分離。

圖4 KPS－1 HPLC圖譜

圖5 KPS－2 HPLC圖譜

2.4 預(yù)處理及超濾分級(jí)效果

將得到的KPS－1和KPS－2溶于50.00mL蒸餾水中，然后分別用30×103Da和50×103Da超濾膜超濾，苯酚－硫酸法測(cè)定各溶液的濃度，結(jié)果見表3。KPS－1經(jīng)30×103Da濾膜過濾后得濾液29.4mL，記作KPS－1－1，非濾過液18.3mL，記作KPS－1－2；KPS－2經(jīng)50×103Da超濾膜超濾后得濾液28.6mL，記作KPS－2－1，非濾過液17.7mL，記作KPS－2－2。KPS－1－1、KPS－1－2、KPS－2－1、KPS－2－2分別用HPLC進(jìn)行純度檢驗(yàn)，見圖6～圖9。

表3 多糖KPS－1和KPS－2處理結(jié)果比較

圖6 KPS－1－1 HPLC圖譜

應(yīng)用超濾膜進(jìn)行過濾多糖有一定的損失，KPS－1損失率為18.22%，KPS－2損失率為13.56%，損失率并不大。與其它分級(jí)方法相比具有速度快、效率高、分級(jí)效果好的特點(diǎn)，因此具有很大的應(yīng)用前途。

圖7 KPS－1－2 HPLC圖譜

圖8 KPS－2－1 HPLC圖譜

圖9 KPS－2－2 HPLC圖譜

超濾后的多糖進(jìn)行 HPLC純度分析，可看出KPS－1經(jīng)超濾分級(jí)得到的兩個(gè)組分KPS－1－1和KPS－1－2其HPLC圖譜都較好，超濾分級(jí)發(fā)揮了很好的效果，是一種重要的分離純化方法。

3 結(jié)論

對(duì)逆流色譜分離海帶多糖的方法進(jìn)行了研究，同時(shí)對(duì)超濾純化多糖的效果進(jìn)行了分析，獲得了較

好的效果。

3.1 建立了逆流色譜分離多糖的雙水相系統(tǒng)，在PEG1000濃度為12%，KH2PO4濃度為8%，K2HPO4濃度為8%，轉(zhuǎn)速在400r/min時(shí)，可以使海帶多糖達(dá)到很好的分離，是多糖分離的又一重要方法。

3.2 研究了超濾在分離純化海帶多糖方面的應(yīng)用效果，結(jié)果表明采用不同的超濾膜可以使多糖達(dá)到較好的純化效果。與傳統(tǒng)的純化方法相比是一種效果好、速度快、損失小的純化方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 獲得了四種多糖組分，分別命名為KPS－1－1、KPS－1－2、KPS－2－1、KPS－2－2，其純度分別為95.24%、94.36%、94.80%和95.57%，獲得了較高的純度，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)分析及活性研究打下了基礎(chǔ)。

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Study on separation and purification of kelp polysaccharide by using countercurrent chromatography and ultrafiltration grade separation method

SONG Guang－lei，DU Qi－zhen
（College of Food Science and Biology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China）

The method of separation and purification of kelp polysaccharide by countercurrent chromatography and ultrafiltration were studied，and good results were achieved.The polysaccharide countercurrent chromatography solvent system was screened out by using the central composite experiment design.12%PEG1000，8%KH2PO4，8%K2HPO4and the rotation speed 400r/min were the best condition.Two of polysaccharides，KPS－1 and KPS－2 were isolated according to the parameters，and the purity was 87.5%and 89.6%respectively.Using ultrafiltration to purify the KPS－1 and KPS－2，the KPS－1－1，KPS－1－2 from KPS－1，and KPS－2－1，KPS－2－2 from KPS－2 were obtained.high performance liquid chromatography（HPLC）analysis result showed that KPS－1 and KPS－2 were purified.

countercurrent chromatography（CCC）；solvent system；ultrafiltration；polysaccharide

TS201.2+3

B

1002－0306（2011）02－0269－05

2009－12－30

宋廣磊（1978－），男，博士研究生，講師，研究方向：功能性食品。