姜 劍，遲玉杰,2,*，孫艷梅，范 淼，王喜波

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，黑龍江 哈爾濱 150030)

分離β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白工藝研究

姜 劍1，遲玉杰1,2,*，孫艷梅3，范 淼1，王喜波1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，黑龍江 哈爾濱 150030)

采用大容量(250×4mL)低速(5300×g)離心機(jī)分離β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白，進(jìn)行堿溶條件、酸沉條件等條件的研究。結(jié)果表明：提取蛋白的堿性溶液(pH8.5的Tris-HCl溶液)離心效果較佳，沉淀大豆球蛋白pH6.4為佳，沉淀β-伴大豆球蛋白pH4.8為佳，用pH5.0沉淀雜蛋白離心分離效果較好；每一個(gè)待離心的濁液，在離心之前4℃冷藏2h以上，對(duì)離心效果的提高十分有效；采用最佳條件，從300g脫脂豆片分離大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，收率分別為6.8%和2.2%，用SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白樣品純度分別為89.1%和78.9%。因此該低速離心法較適合數(shù)十克級(jí)別的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的分離。

β-伴大豆球蛋白；大豆球蛋白；分離

大豆分離蛋白是用低變性脫脂大豆粕為原料，采用現(xiàn)代化加工技術(shù)來(lái)制取的一種蛋白質(zhì)含量極高的功能性食品原料[1]。大豆分離蛋白具有多種功能特性[2]，其在食品工業(yè)中主要應(yīng)用于乳制品、肉制品、烘焙食品、面制品等加工[3]。近些年來(lái)大豆分離蛋白在非食品行業(yè)中也有很多重要用途[4]。大豆蛋白的一個(gè)主要分類(lèi)方式是根據(jù)離心分離系數(shù)(即沉降系數(shù))不同分類(lèi)，分為2S、7S、11S、15S 4種組分，對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量分別是25、160、350、600kD。目前工藝上大豆分離蛋白的生產(chǎn)主要就是堿溶酸沉[5]，其中，15S組分由大豆球蛋白聚集體或大分子聚合物組成，在提取時(shí)不溶。而大多數(shù)2S組分在酸性條件下也不沉淀，保持溶解狀態(tài)，稱(chēng)為乳清蛋白。所以，大豆分離蛋白的主要組成成分是7S和11S組分，在大豆分離蛋白中含量分別約為37%和31%。大豆球蛋白是11S球蛋白。β-伴大豆球蛋白是7S球蛋白的一個(gè)主要的成分，當(dāng)然簡(jiǎn)單的把7S球蛋白和β-伴大豆球蛋白等同看待是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹１緦?shí)驗(yàn)為了尊重文獻(xiàn)，同時(shí)使用7S和11S球蛋白。

1976年以前，11S球蛋白的分離方法主要有Koshiyama法[6]、Saio法[7]和Thanh法[8]等。一般文獻(xiàn)中較多采用了Thanh法分離7S和11S大豆球蛋白。隨后又有Nagano法[9]、Wu 法[10]、雷繼鵬法[11]、Liu 法[12]和 Deak 法[13]等分離β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白方法出現(xiàn)。這些研究以前人研究為基礎(chǔ)不斷完善，產(chǎn)率純度都有了較大提高，分離步驟不斷簡(jiǎn)化。Nagano法也被廣泛采用，如Wu等[10]使用修改了的Nagano法成功地生產(chǎn)出千克級(jí)的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白。王孝英等[14]通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)比較了Nagano法、Thanh法和Saio法3種方法分離7S和11S大豆球蛋白的效果，結(jié)論是Nagano法分離得到的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白大豆球蛋白純度最高，分別達(dá)到71.5%和70.5%，Thanh法居中，Saio法分離的效果則相對(duì)較差，純度只能達(dá)到60.5%和40.4%。

以上這些分離方法均需要高速冷凍離心機(jī)，如Thanh法離心轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心溫度2～5℃；其他分離方法中，4℃，離心轉(zhuǎn)速最低為6500×g。大容量高速冷凍離心機(jī)昂貴，即使是普通冷凍離心機(jī)(200mL)在很多實(shí)驗(yàn)室也達(dá)不到普及的程度。本實(shí)驗(yàn)研究使用大容量(250×4mL)低速(5300×g)離心機(jī)分離β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂豆片 哈爾濱高科技(集團(tuán))股份有限公司；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2 儀器與設(shè)備

TD5M低速大容量離心機(jī)(最大轉(zhuǎn)速5500r/min≈5300×g，最大容量250×4mL) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FDU-1100型冷凍干燥機(jī) 日本Tokyo Rikakikai公司；DYY-Ⅲ-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 江蘇南達(dá)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.3 方法

1.3.1β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白分離流程

1.3.2β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白分離方法

1.3.2.1 堿溶方案

100g脫脂豆片與2L的堿提取液在室溫條件下，用攪拌機(jī)攪拌1h，提取蛋白。然后放入4℃冰箱，冷藏2h，得渾濁液。將該渾濁液除去上層泡沫后，用離心機(jī)4500r/min，20min離心分離。沉淀全部棄去，得上清液。

1.3.2.2 酸沉分級(jí)分離

向上述堿溶液的上清液加入亞硫酸氫鈉至0.01mol/L。充分?jǐn)嚢韬笥?mol/L HCl溶液調(diào)pH6.4，進(jìn)行第1次酸沉。該次酸沉濁液于4℃冷藏過(guò)夜放置后，4500r/min、20min離心分離，沉淀為大豆球蛋白。同時(shí)分離得到的上清液中加入固體NaCl至濃度0.25mol/L，加入1mol/L HCl溶液調(diào)pH5.0，進(jìn)行第2次酸沉。得濁液放入冰箱冷藏2h后，4500r/min、20min離心分離，得沉淀為雜蛋白，棄去。同時(shí)得到的上清液用蒸餾水稀釋2倍。加入1mol/L HCl溶液調(diào)pH4.8，進(jìn)行第3次酸沉，得濁液冷藏過(guò)夜后，立即4500r/min、20min離心分離。棄去上清液，沉淀為β-伴大豆球蛋白。

1.3.2.3 蛋白粗品的純化和干燥

沉淀大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分別加4倍體積的蒸餾水后攪拌，加入1mol/L NaOH溶液調(diào)pH7.00。放入分子質(zhì)量10000D透析袋，并用蒸餾水冷藏×透析3d。冷凍干燥機(jī)凍干。

1.3.3 最佳分離條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用最佳條件，用300g脫脂豆片，加6L緩沖溶液提取分離β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白。依據(jù)1.3.1節(jié)的分離流程，第一次酸沉后離心所得沉淀經(jīng)中和，透析，凍干得大豆球蛋白干質(zhì)量A，計(jì)算大豆球蛋白第三次酸沉后離心所得

沉淀經(jīng)中和，透析，凍干得β-伴大豆球蛋白干質(zhì)量B，計(jì)算得β-伴大豆球蛋白收率

1.3.4 SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)方法

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)法對(duì)SPI的組分及各組分的百分含量進(jìn)行分析，濃縮膠和分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.0%和12.5%。pH8.8分離。電泳凝膠色帶用掃描儀掃描，然后用Bandscan軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

表1 堿提取溶液4種方案Table 1 Four designs for protein extraction with alkali solution

2.1 堿溶方法

β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的分離主要采用堿性溶劑，調(diào)酸性分步沉淀β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白。不同文獻(xiàn)堿性提取在8.0～8.5之間，基于堿用量較少可節(jié)約成本的考慮，部分文獻(xiàn)采用pH8.0堿溶液提取，Liu等[6]通過(guò)數(shù)據(jù)對(duì)比認(rèn)為pH8.5提取效果較好。堿性溶液有兩種，一種是NaOH溶液，另外有些文獻(xiàn)傾向于用Tris-HCl溶液。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同堿性溶液分離大豆球蛋白球蛋白效果。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)與高速冷凍離心條件相比，在當(dāng)前的離心條件下，大豆球蛋白沉淀的沉降確實(shí)困難。采用100g脫脂豆片提取大豆球蛋白時(shí)，大豆球蛋白濕蛋白產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)用NaOH溶液提取分離大豆球蛋白，4500r/min離心只能看到很少的沉淀，而文獻(xiàn)用9000×g、4℃離心時(shí)，可以達(dá)到較好離心分離效果。用Tris-HCl溶液提取分離大豆球蛋白，4500r/min離心分離沉淀量明顯提高，約是NaOH溶液提取分離方法的4倍。因此，確定提取蛋白的堿性溶液為0.03mol/L pH8.5的Tris-HCl溶液。

圖1 大豆球蛋白濕蛋白產(chǎn)量Fig.1 Yield of wet glycinin

由于提取需要使用0.03mol/L pH8.5的Tris-HCl溶液提取，而Tris-HCl溶液較脫脂豆片成本高，因此，僅對(duì)脫脂豆片進(jìn)行一次提取。

2.2 酸沉方法

2.2.1 酸沉pH值的確定

大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的分離是利用大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白在不同pH值時(shí)的溶解度，通過(guò)調(diào)pH值，令他們分步沉淀，實(shí)現(xiàn)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的分級(jí)分離，為了提高大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的純度，在沉大豆球蛋白之后和沉β-伴大豆球蛋白之前，還沉了一次雜蛋白。因此，調(diào)3次pH值，沉淀3次。一般文獻(xiàn)沉淀大豆球蛋白的pH6.4。pH4.8沉淀β-伴大豆球蛋白pH4.8。本實(shí)驗(yàn)也是采用這兩個(gè)pH值沉淀大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。然而，一般文獻(xiàn)沉淀沉雜蛋白的pH值則在5.0～5.5之間。如Nagano和Wu都是用pH5.0沉淀雜蛋白，而Liu是用pH5.5沉淀雜蛋白。他們離心分離在9000×g、4℃條件下實(shí)現(xiàn)的。常溫條件下，4500r/min離心時(shí)，pH5.5沉淀雜蛋白離心分離很困難，上清液仍然十分混濁，雜蛋白沉淀少到與上清液難于分離，常隨上清液一塊倒出。用pH5.0沉淀雜蛋白，離心分離效果較好。

2.2.2 離心效果的提高

每一個(gè)待離心的濁液，在離心之前，在4℃冷藏一段時(shí)間，對(duì)離心效果的提高十分有效。通常文獻(xiàn)只是對(duì)分離大豆球蛋白用的濁液進(jìn)行了過(guò)夜冷藏處理，因?yàn)楸娝苤蠖骨虻鞍诪槔涑两M分。由于本研究采用的不是冷凍離心機(jī)，其他待離心的濁液直接用離心機(jī)離心效果遠(yuǎn)沒(méi)有經(jīng)過(guò)冷藏處理的離心效果好。經(jīng)過(guò)冷藏處理的經(jīng)離心后，上清液清澈，而沒(méi)有經(jīng)過(guò)冷藏處理的離心上清液明顯渾濁。本研究把待離心的濁液，在離心之前，在4℃冷藏至少2 h以上。其中對(duì)分離大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白用的濁液均進(jìn)行了過(guò)夜冷藏處理。這樣，一個(gè)從脫脂豆片提取分離大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白蛋白沉淀的周期為2.5d。時(shí)間上雖然較長(zhǎng)，但分離效果好，樣品處理量大，對(duì)離心機(jī)的要求較低，適合較多大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白樣品的分離制備。

2.3 SDS-PAGE電泳測(cè)定大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白樣品純度

SDS-PAGE電泳技術(shù)測(cè)定了最佳條件分離條件下制得的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白樣品純度。用Bandscan軟件，對(duì)SDS-PAGE電泳圖像中條帶進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量和含量分析。其中泳帶1和泳帶2中，各取15個(gè)明顯條帶，處理情況見(jiàn)圖2。泳帶1和泳帶2中各條帶由上向下編號(hào)，其相對(duì)分子質(zhì)量和含量分析結(jié)果列于表2。

圖2 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白樣品電泳圖和Bandscan軟件選取的15個(gè)明顯條帶Fig.2 Fifteen clear bands selected from electrophoresis picture ofβ-conglycinin and glycinin by Bandscan software

表2 大豆球蛋白組分和β-伴大豆球蛋白組分中亞基相對(duì)分子質(zhì)量和含量分析Table 2 Analysis of molecular weights and contents of subunits inβ-conglycinin and glycinin fractions

β-伴大豆球蛋白含有3種類(lèi)型亞基，即α、α'、β。β-伴大豆球蛋白是這3種亞基以不同的方式結(jié)合的三聚體。α(68kD)α'(72kD)β(52kD)[15]。大豆球蛋白的單聚體亞基是一個(gè)由一個(gè)酸性多肽和一個(gè)堿性多肽以一個(gè)二硫鍵相連的蛋白，結(jié)構(gòu)表示為A-S-S-B。其中A代表酸性多肽鏈，B代表堿性多肽鏈，S-S是二硫鍵。組成亞基的酸性多肽鏈有6種[A1a(37kD) A1b(37kD) A2(37kD) A3(42kD) A4(37kD) A5(10kD)[15]]，堿性多肽鏈有5種B1a(20kD) B1b(20kD) B2(20kD) B3(略大于20kD) B4(20kD)[15]。條帶分析發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白樣品亞基種類(lèi)較全，可能是脫脂豆片品種不單一等。

結(jié)果統(tǒng)計(jì)表明，該大豆球蛋白組分中大豆球蛋白含量89.1%，β-伴大豆球蛋白組分中β-伴大豆球蛋白78.9%?？梢?jiàn)，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白樣品純度較高，基本達(dá)到了預(yù)期效果。

2.4β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白最佳分離條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用最佳方案，用300g脫脂豆片加6L緩沖溶液提取β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白。各分離階段分離結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白分離結(jié)果Table 3 Separation results ofβ-conglycinin and glycinin

用SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白樣品純度分別為89.1%和78.9%。大豆球蛋白收率為6.8%，收率較文獻(xiàn)9%～10%的收率略小，β-伴大豆球蛋白收率為2.2%，該收率較文獻(xiàn)9%～10%的收率小很多。但一次可以制備具有如此純度的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白樣品的量(大豆球蛋白20.5g和β-伴大豆球蛋白6.5g)還是達(dá)到了預(yù)期的效果。

3 結(jié) 論

本研究嘗試了用大容量低速(5300×g)離心機(jī)(1L)分離β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白。進(jìn)行堿溶條件、酸沉條件等條件的探討，發(fā)現(xiàn)提取蛋白的堿性溶液為pH8.5的Tris-HCl溶液較佳，沉淀大豆球蛋白的pH6.4，沉淀β-伴大豆球蛋白pH4.8。用pH5.0沉淀雜蛋白，離心分離效果較好。每一個(gè)待離心的濁液，在離心之前，在4℃冷藏2h以上，對(duì)離心效果的提高十分有效。用最佳條件，從300g脫脂豆片分離大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，收率分別為6.8%和2.2%。用SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白樣品純度分別為89.1%和78.9%。該方法較適合幾十克級(jí)別的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的制備。

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An Investigation into the Separation Process forβ-Conglycinin and Glycinin

JIANG Jian1，CHI Yu-jie1,2,*，SUN Yan-mei3，F(xiàn)AN Miao1，WANG Xi-bo1
(1. School of Food Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. Key Laboratory of Soybean Biology, Ministry of Education, Harbin 150030, China；3. Department of Application Chemistry, College of Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

β-conglycinin and glycinin were separated by large-capacity (250 × 4 mL) low-speed (5300 ×g) centrifugation at the condition of alkali dissolution and acid precipitation. Results indicated that better centrifugation efficiency of soybean protein was in pH 8.5 Tris-HCl solution; The optimal pH values for precipitating glycinin andβ-conglycinin were 6.4 and 4.8, respectively. Meanwhile, the optimal pH for removing the impure proteins was 5.0. The enhancement of entrifugation efficiency was achieved by keeping turbid liquid at 4 ℃ for more than 2 h before centrifugation. Under the optimal conditions, the yields of glycinin andβ-conglycinin were 6.8% and 2.2%, respectively. The purities of separated proteins determined by SDS-PAGE were 89.1% and 78.9%. Low-speed centrifugation is suitable for separatingβ-conglycinin and glycinin.

β-conglycinin；glycinin；separation

Q816

A

1002-6630(2011)06-0011-05

2010-04-24

黑龍江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(ZD200902)

姜?jiǎng)?1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：jiangjian.113@163.com

*通信作者：遲玉杰(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)及農(nóng)產(chǎn)品深加工。E-mail：yjchi@126.com