黑龍江省中醫(yī)研究院（150036）張春戩 鄭佳新 馮麗輝

蘇木，豆科云實(shí)屬，藥用部位為其干燥心材。近年來，國內(nèi)外一些研究表明，蘇木具有抑制T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的作用。本研究通過觀察蘇木醇提物對（dendritic cell，DC）IL-12 P40mRNA轉(zhuǎn)錄的影響，在細(xì)胞分子水平闡述其調(diào)節(jié)免疫的作用機(jī)制。樹突狀細(xì)胞在體內(nèi)分布廣泛，是唯一能激活初始型T細(xì)胞的抗原提成細(xì)胞，能夠調(diào)節(jié)和調(diào)控細(xì)胞免疫功能[1]。IL-12是近年來發(fā)現(xiàn)的一種異源二聚體分子，主要由樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞對細(xì)菌、細(xì)菌產(chǎn)物及細(xì)胞內(nèi)寄生物等發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生，是啟動(dòng)免疫殺傷最主要的細(xì)胞因子。

附圖 對照組與各治療組IL-12電泳圖

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑動(dòng)物 近交系BALB／c小鼠（16～20g），C57BM小鼠（20～25g），購于哈爾濱市獸研所。允許動(dòng)物在無特殊病原體環(huán)境中隨意進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)的飼料和純凈水。

1.2 主要試劑 蘇木醇提物，黑龍江省中醫(yī)研究院制劑室提供；重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte.macrophage colony stimulating Factor，GM—CSF），購自美國Biosource公司；胎牛血清（Fetal calf serum，F(xiàn)CS）和RPMI l640培養(yǎng)基，購自美國Hyclone公司。

1.3 小鼠骨髓DC培養(yǎng) DC細(xì)胞的分離培養(yǎng)及分組參照文獻(xiàn)[2]方法，無菌條件下提取BALB／c小鼠脛骨和股骨骨髓細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解后配制成l×106／m1細(xì)胞懸液接種于6孔板中（1.5～2.5m1／孔），并在每孔中加入2m1含10%胎牛血清的RPMIl640培養(yǎng)基，最后加入GMCSF（終濃度為0.02mg／m1）和IL-4（500U／m1），培養(yǎng)7天。然后將GM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)7天的骨髓來源DC細(xì)胞進(jìn)行分組，采取不同處理：對照組不做任何處理；蘇木醇提物高劑量組（20μg／m1）、中劑量組（10μ g／m1）、低劑量組（5μg／ml）。上述各組DC繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集懸液細(xì)胞。

1.4 電鏡分析 將DC細(xì)胞懸液用PH7、0.1mol／LPBS洗滌后，1000r／min離心5min，4%戊二醛固定，PBS洗滌，制成懸液滴片，1%鋨酸固定，梯度乙醇脫水，掃描電鏡觀察，攝片。

1.5 RT-PCR測定IL-12 P40mRNA的轉(zhuǎn)錄細(xì)胞總RNA的提取采用TRIzolR試劑，cDNA合成采用隨機(jī)引物法，PCR擴(kuò)增條件為 ：94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)。IL-12 P40序列及擴(kuò)增片段長度5’-GGA TGC CCC TGG AGA AAT GG-3’5’AGG TGG AGG TCA GCT GGG AG-3’655bp。取IL-12 P40 得PCR產(chǎn)物5μl，在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳（含0.5 μl/ml溴化乙錠）30min，紫外透射儀下觀察結(jié)果并攝片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSSl3.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC的掃描電鏡觀察 成熟DC的形態(tài)極不規(guī)則，有管狀斧狀偽足，有球莖狀、泡狀等細(xì)胞突起，長短不一，且表面光滑，構(gòu)成不規(guī)則的形態(tài)，細(xì)胞表面有折疊結(jié)構(gòu)。

2.2 IL-12 P40mRNA的表達(dá)結(jié)果：IL-12mRNA 與β-actin像素值比值均大于對照組（P＜0.05），見附圖。

3 討論

蘇木，功效主治閉經(jīng)、痛經(jīng)、產(chǎn)后惡露不盡、中風(fēng)、癰疽瘡毒等，是臨床常用活血化瘀中草藥。近年的研究表明，蘇木除具有傳統(tǒng)療效外，還具有抗炎及免疫抑制作用。蘇木水提物對HL-60（人早幼粒白血病細(xì)胞株）有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用；在體外有與雷公藤相似的抑制人B淋巴細(xì)胞增殖作用及較強(qiáng)的抗器官排斥反應(yīng)作用[3]。其醇提物對人體腫瘤細(xì)胞HCT-8、KB有明顯的抑制作用，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究中，將BALB／c小鼠脛骨和股骨骨髓細(xì)胞經(jīng)GM-CSF誘導(dǎo)而來的DC細(xì)胞進(jìn)行分組，用蘇木醇提物處理，RT-PCR測定IL-12 P40mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果表明，經(jīng)給予蘇木醇提物處理的DC能夠分泌高水平的IL-12 P40，進(jìn)而促使T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為殺傷性T細(xì)胞，提高T細(xì)胞的殺傷活性，找出蘇木醇提物對DC的藥物作用靶點(diǎn)之一，為進(jìn)一步研究蘇木的免疫調(diào)節(jié)作用，以及從中藥中尋找具有明確免疫抑制作用和低副作用的免疫抑制劑打下了良好的基礎(chǔ)。