包毅寧，胡易，王正珊，趙征

（天津科技大學，天津300457）

瑞士乳桿菌發(fā)酵乳清產(chǎn)物抗氧化活性的條件優(yōu)化

包毅寧，胡易，王正珊，趙征

（天津科技大學，天津300457）

應用產(chǎn)蛋白酶活力強的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳清，討論了發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵初始pH值和瑞士乳桿菌接種量等條件對產(chǎn)物抗氧化活性的影響。在單因素實驗的基礎上，進行正交實驗，得到抗氧化活性最高產(chǎn)物的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度37℃、乳清初始pH值為6.0、瑞士乳桿菌接種量（體積分數(shù)）5%和連續(xù)培養(yǎng)18 h。在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的羥自由基清除能力達到54.73%。證明了瑞士乳桿菌發(fā)酵乳清產(chǎn)物具有優(yōu)于未發(fā)酵乳清的較強抗氧化活性，在現(xiàn)有酶解法的基礎上開辟了制備乳清源抗氧化肽的新途徑。

瑞士乳桿菌；乳清；抗氧化；羥自由基；水解

0 引言

隨著干酪產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，乳清再利用受到了人們的重視。乳清具有多方面的功能性，近年來乳清的抗氧化性成為研究熱點，提高乳清抗氧化活性的方法目前主要為酶解法。Pena-Ramos等發(fā)現(xiàn)乳清分離蛋白酶解產(chǎn)物在脂質系統(tǒng)中有良好的的抗氧化能力[1]；趙文博等證明了堿性蛋白酶可提高乳清的抗氧化能力[2]。瑞士乳桿菌是一種高產(chǎn)蛋白酶活性的乳酸菌[3]，Kapila等對用瑞士乳桿菌發(fā)酵乳清和添加WPC乳清的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。體外試驗結果表明，瑞士乳桿菌水解產(chǎn)物具有很好的抗氧化活性[4]。本工作擬利用瑞士乳桿菌發(fā)酵濃縮乳清，利用乳酸菌所產(chǎn)蛋白酶將乳清蛋白水解，以提高乳清的抗氧化活性，力求為乳清功能性的提高提供酶解以外的新途徑。

1 實驗

1.1 材料與儀器

瑞士乳桿菌（天津科技大學干酪科學與工程研究室保藏），鮮牛乳，鹽酸、FeSO4、雙氧水、水楊酸（分析純）。

乳脂分離機（9N-100），立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50SⅡ），電熱恒溫水浴鍋（HWS26型），紫外可見分光光度計（752E），pH計（FE20），RE-52AA旋轉蒸發(fā)器，5804R低溫離心機，BCM-1000A型生物潔凈工作臺，LRH-250培養(yǎng)箱，真空冷凍干燥機。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

鮮牛乳加熱至35℃→脫脂→殺菌（63℃/30 min）→冷卻至45℃→加稀釋比1︰9的鹽酸至pH值為4.6并不斷輕輕攪拌[5]→過濾除去酪蛋白得到酸乳清→55～60℃真空旋蒸除去原體積2/3的水→調節(jié)濃縮乳清的pH→灌入無菌三角瓶→殺菌（63℃/30 min）→接種瑞士乳桿菌→靜置發(fā)酵→4℃離心除去菌體→上清液滅酶（沸水浴5 min）→真空凍干（-55℃/48 h）得產(chǎn)物→測定產(chǎn)物的1%溶液的抗氧化性。

1.2.2 瑞士乳桿菌活化方法

瑞士乳桿菌凍干菌粉接入質量分數(shù)為12%滅菌的脫脂乳粉復原乳進行活化，凝乳后按體積分數(shù)為3%接種量接入10 mL液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，然后后按體積分數(shù)為3%接種量接入100 mL液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后使用。

1.2.3 抗氧化指標的測定

清除羥自由基能力。在10 mL試管中依次加入濃度為6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL，發(fā)酵產(chǎn)物溶液2 mL和濃度為6 mmol/L的H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min。再向Ai各管加入濃度為6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，同時向Aj各管加入2 mL蒸餾水，搖勻，靜置30 min后以5 000 r/min離心5 min，于510 nm處測吸光度[6]。每個樣品測3次，取平均。清除率計算公式為

清除率=[1-(Ai-Aj/A0)]×100%，

式中：A0為空白對照；Ai為有水楊酸時水解產(chǎn)物的吸光度；Aj為無水楊酸時水解產(chǎn)物的吸光度。

1.2.4 單因素實驗

（1）時間的影響。培養(yǎng)溫度42℃，發(fā)酵初始pH值為6.0，接種量（體積分數(shù)）5.0%，每隔2小時取樣，凍干后測產(chǎn)物抗氧化活性。

（2）溫度的影響。發(fā)酵初始pH值為6.0，接種量（體積分數(shù)）5.0%，分別置于25，30，37，42，50℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)18 h后取樣，凍干后測產(chǎn)物抗氧化活性。

（3）初始pH值的影響。培養(yǎng)溫度42℃，發(fā)酵初始pH值分別為5.0，5.5，6.0，6.5和7.0，接種量（體積分數(shù)）5.0%，培養(yǎng)18 h，凍干后測產(chǎn)物抗氧化活性。

（4）瑞士乳桿菌接種量的影響。培養(yǎng)溫度42℃，發(fā)酵初始pH值為6.0，瑞士乳桿菌接種量（體積分數(shù)）分別為0%，2.5%，5.0%，7.5%和10.0%，培養(yǎng)18 h，凍干后測產(chǎn)物抗氧化活性。

正交實驗結果如表1所示。

2 結果與討論

2.1 時間對產(chǎn)物抗氧化活性的影響

圖1為發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化性與發(fā)酵時間的關系。由圖1可以看出，瑞士乳桿菌發(fā)酵濃縮乳清產(chǎn)物的抗氧化活性隨發(fā)酵時間延長呈增加趨勢，到18 h達到49.24%。發(fā)酵18 h后，產(chǎn)物的抗氧化活性開始降低，實驗中測得發(fā)酵至48 h的水解產(chǎn)物的羥自由基清除能力為45.76%，略高于發(fā)酵20 h的產(chǎn)物。由發(fā)酵液中活菌數(shù)曲線可以看出從16 h到18 h的發(fā)酵過程中活菌大量死亡，其破裂釋放的胞內蛋白酶進一步水解乳清蛋白產(chǎn)生了抗氧化肽，故18 h的水解產(chǎn)物呈現(xiàn)出更好的抗氧化活性。

2.2 溫度對產(chǎn)物抗氧化活性的影響

溫度影響微生物的各種代謝過程和酶催化的各種生化反應速率，從而影響菌體的生長和蛋白酶的水解效力。溫度還通過改變發(fā)酵液的物理性質，如樣的溶解度、基質的傳遞速率及菌體對養(yǎng)分的分解和吸收速率，間接影響微生物的生長和產(chǎn)物的形成。圖2為發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化性與發(fā)酵溫度的關系。由圖2可以看出，瑞士乳桿菌發(fā)酵濃縮乳清產(chǎn)物的抗氧化活性隨發(fā)酵溫度升高呈增加趨勢，當發(fā)酵溫度為42℃時達到52.54%。溫度繼續(xù)升高，抗氧化活性顯著下降。這可能是由于瑞士乳桿菌產(chǎn)酶及所產(chǎn)蛋白酶的最適作用溫度在37～42℃，溫度過高影響了乳酸菌產(chǎn)酶和所產(chǎn)蛋白酶的水解作用，進而減少了抗氧化肽的生成量，降低了產(chǎn)物的抗氧化活性。

圖2 產(chǎn)物抗氧化性與溫度的關系

2.3 pH值對產(chǎn)物抗氧化活性的影響

乳清的初始pH值可能從兩個方面影響瑞士乳桿菌的生長和蛋白水解能力：一是影響菌體細胞膜電荷狀況，引起膜滲透性的變化，從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收；二是影響菌體細胞內各種酶活、菌體對基質的利用速率和細胞的結構，從而影響菌體的生長和產(chǎn)蛋白酶能力[7]。圖3為發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化性與發(fā)酵初始pH值的關系。由圖3可以看出，瑞士乳桿菌發(fā)酵濃縮乳清產(chǎn)物的抗氧化活性隨在初始pH值為6.5時達到最大，此條件下的清除率為51.3%，這與瑞士乳桿菌的最適生長pH值為6.2～6.4相近，說明在此條件下瑞士乳桿菌能夠較高的吸收養(yǎng)分，且具有良好的產(chǎn)酶活性。

圖3 產(chǎn)物抗氧化性與pH值的關系

2.4 接種量對發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的影響

圖4為發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化性與接種量（體積分數(shù)）的關系。由圖4可以看出，瑞士乳桿菌發(fā)酵濃縮乳清產(chǎn)物的抗氧化活性在接種量（體積分數(shù)）為7.5%時清除率達到51.92%，高于接種量為10%時產(chǎn)物的抗氧化活性，這可能是由于接種量增大使培養(yǎng)過程中菌體之間競爭營養(yǎng)物質而大量死亡，釋放了過量的蛋白酶使乳清蛋白水解為抗氧化肽后又進一步水解，抗氧化活性降低。

圖4 產(chǎn)物抗氧化性與接種量的關系

2.5 正交實驗

正交實驗由表2所示。由表2可以看出，對瑞士乳桿菌發(fā)酵乳清水解產(chǎn)物抗氧化活性影響程度大小按順序依次為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞接種量＞發(fā)酵液初始pH值。最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間18 h，發(fā)酵初始pH值為6.0，接種量（體積分數(shù)）10%。

對發(fā)酵條件優(yōu)化實驗進行方差分析，結果如表3所示。方差分析結果顯示，以初始pH為誤差項，在a=0.05水平上，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間具有顯著性，接種量和初始pH沒有顯著性。綜合考慮方差分析結果與經(jīng)濟因素，選擇發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時間18h、發(fā)酵初始pH6.0、接種量5%，所得水解產(chǎn)物的羥自由基清除率為54.73%。而對照組中未接種瑞士乳桿菌乳清的羥自由基清除率為33.21%。

表2 正交實驗結果

表3 方差分析

3 結論

瑞士乳桿菌可以顯著提高濃縮乳清的抗氧化活性，發(fā)酵初始pH值為6.0、瑞士乳桿菌接種量（體積分數(shù)）5%的濃縮乳清在37℃發(fā)酵18 h后，所得水解產(chǎn)物的羥自由基清除率為54.73%。與酶法水解相比，用微生物水解法制備生物活性肽直接利用微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的復合蛋白酶降解蛋白質，經(jīng)過優(yōu)化可達到較高的水解度，從而降低了制備低聚肽的成本，為綜合開發(fā)利用乳清提供了思路。

[1] PENA-RAMOS E A,XIONG Y L.Antioxidative Activity of Whey Protein Hydrolysates in a Liposomal System[J].Journal of Dairy Science,2001,84:2577–2583.

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Optimum fermentation conditions ofLactobacillus helveticusfor producing antioxidative cheese whey

BAO Yi-ning,HU Yi,WANG Zheng-shan,ZHAO Zheng
(Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

This study focused on the antioxidative property of cheese whey fermented by aLactobacillus helveticuswhich was proved to be excellent on producing the proteinase.After the single factor tests,the orthogonal test was carried out to obtain the optimal fermentation con dition to get the product with the best antioxidative activity.The optimal fermentation conditions are as following:incubation temperature 37℃,initial pH 6.0,inoculation 5%(vol/vol),and fermented 18 h.After fermented in this condition,the ability to eliminate free radical of the product is up to 54.73%.This study proved that after fermented by theLactobacillus helveticus,the antioxidative activity of the cheese whey could be improved,and developed a new way to prepare the antioxidative peptides from whey.

Lactobacillus helveticus;whey;antioxidation;free radical；hydrolysis

Q93-33

A

1001-2230（2011）03-0007-03

2010-11-30

天津市科技攻關項目“瑞士乳桿菌發(fā)酵技術及其系列產(chǎn)品的工業(yè)化開發(fā)”（06YFGZSH02300）。

包毅寧（1985－），女，碩士研究生，研究方向為乳品科學與技術。

趙征