朱洪艷，趙紅宇，周盛華，高學(xué)軍

（1.黑龍江康普生物科技有限公司，哈爾濱150000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

牛初乳中sIgA雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立

朱洪艷1，趙紅宇1，周盛華1，高學(xué)軍2

（1.黑龍江康普生物科技有限公司，哈爾濱150000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

為定量檢測(cè)牛初乳中sIgA，建立雙抗夾心ELISA方法。以牛初乳中的sIgA為抗原，免疫新西蘭白兔，制得抗血清，經(jīng)純化后作為包被抗體；利用簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法對(duì)兔抗牛sIgA標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，制得酶標(biāo)抗體；通過(guò)方陣滴定法確定ELISA最佳工作條件；進(jìn)行特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)并且檢測(cè)牛初乳粉樣本中的sIgA含量。結(jié)果：成功建立了一種定量檢測(cè)牛初乳中sIgA的雙抗夾心ELISA方法。該方法線性范圍：15.625～1 000 μg/L；最低檢測(cè)限（LOD）為15.625 μg/L；精密度為：批內(nèi)CV=4.8%；批間CV=6.5%。

ELISA，sIgA，牛初乳

0 引言

sIgA是外分泌液中存在的主要抗體，它具有和人初乳相同的免疫源性，是呼吸道、消化道、泌尿生殖道等抵御病毒、細(xì)菌等病原及有害物質(zhì)入侵的第一道免疫屏障。研究發(fā)現(xiàn)sIgA能聚集細(xì)菌和病毒形成復(fù)合物，而易被黏膜屏障所阻擋或通過(guò)糞便、痰液及鞘膜液等分泌作用排出體外，是人體黏膜免疫的主要抗體[1-3]。然而，目前牛初乳類產(chǎn)品國(guó)內(nèi)外缺乏必要的檢測(cè)方法，此種方法的建立為牛初乳類產(chǎn)品的工業(yè)化開(kāi)發(fā)與檢測(cè)提供一種準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定的檢測(cè)手段。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

牛sIgA蛋白，兔抗牛sIgA多克隆抗體（自制），可溶型單組份TMB底物溶液，辣根過(guò)氧化物酶，牛初乳粉，96孔酶標(biāo)板（Nunc）；Bovine IgA ELISA Quantitation Kit試劑盒，SeperdexG-25，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑，實(shí)驗(yàn)室用水均為去離子水。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀（BIO﹣RAD680），微量移液器，高速冷凍離心機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 包被抗體的制備

取4只6～8周齡、雄性、健康新西蘭白兔。分成2組，第一組3只，為被免疫兔，第二組1只設(shè)為陰性對(duì)照。采用頸、背部皮下多點(diǎn)注射的方法進(jìn)行免疫，每只兔每次2 mg（以蛋白量計(jì)）牛sIgA蛋白免疫原，每隔15 d免疫1次。第3次免疫后10 d，耳靜脈取血，間接ELISA法檢測(cè)兔血清效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到1︰10 000時(shí)心臟采血，制備抗血清。

抗血清經(jīng)飽和（NH4）2SO4鹽析后，過(guò)SeperdexG-25柱除鹽，收集除鹽后的溶液，PEG-6000透析濃縮，濃縮后的溶液即為兔抗牛sIgA抗體，檢測(cè)效價(jià)后，分裝、-20℃凍存。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)純化后抗體濃度。

1.3.2 酶標(biāo)抗體的制備

采用簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法[4]對(duì)純化的兔抗牛sIgA抗體標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（HRP），加甘油分裝后，-20℃凍存。

1.3.3 雙抗夾心ELISA方法的建立

以方陣滴定法分別確定包被抗體的最佳稀釋度和工作條件；最適封閉液和作用時(shí)間；酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度和作用時(shí)間；底物溶液的最佳反應(yīng)時(shí)間。建立ELISA的最佳實(shí)驗(yàn)條件。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以牛sIgA蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，系列稀釋質(zhì)量濃度：1000，500，250，125，62.5，31.25，15.625 μg/L，按照已確定的ELISA最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)定樣品稀釋液為陰性對(duì)照，TBST為空白對(duì)照，平行測(cè)定20次。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白sIgA的質(zhì)量濃度為自變量，其所對(duì)應(yīng)的OD450nm值平均值減去空白OD450nm值為應(yīng)變量，利用ELISACalc數(shù)據(jù)分析專用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低檢測(cè)限和線性范圍。

1.3.5 特異性實(shí)驗(yàn)

選取與待檢蛋白性質(zhì)相近的另外幾種乳蛋白：牛免疫球蛋白G（IgG）、牛免疫球蛋白M(IgM)、乳鐵蛋白（LF）、酪蛋白進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，每種蛋白重復(fù)兩個(gè)孔，設(shè)置樣品稀釋液為陰性對(duì)照，sIgA的最低檢出限為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)抽取14個(gè)批次的牛初乳粉樣，同時(shí)進(jìn)行批內(nèi)和批間檢測(cè)，批內(nèi)設(shè)兩個(gè)平行，批間設(shè)10個(gè)平行，設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

包被抗體的破壞性實(shí)驗(yàn)：將已包被的酶標(biāo)板，置于37℃72 h，取出，以1.1.3建立的程序檢測(cè)sIgA標(biāo)準(zhǔn)品溶液（62.5 ng/mL），設(shè)兩個(gè)平行，計(jì)算所測(cè)得的sIgA質(zhì)量濃度占sIgA標(biāo)準(zhǔn)溶液初始質(zhì)量濃度的百分比；酶標(biāo)抗體的破壞性實(shí)驗(yàn)：1︰3000稀釋酶標(biāo)抗體后，分成小支，約1 mL/支，置于37℃72 h，取出，按1.1.3建立的ELISA程序?qū)嶒?yàn)，檢測(cè)sIgA標(biāo)準(zhǔn)品溶液（62.5 μg/L），設(shè)置兩個(gè)平行，計(jì)算所測(cè)得的sIgA質(zhì)量濃度占sIgA標(biāo)準(zhǔn)溶液初始質(zhì)量濃度的百分比。

1.3.8 牛初乳粉樣本的檢測(cè)

隨機(jī)抽取50個(gè)牛初乳粉樣，用建立的ELISA方法（設(shè)為A方法）測(cè)定其中的sIgA質(zhì)量濃度，在相同條件下與Bovine IgA ELISA Quantitation Kit試劑盒（設(shè)為B方法）的檢測(cè)結(jié)果作對(duì)照，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析這兩種方法的符合性。

2 結(jié)果

2.1 抗血清純化前后效價(jià)的測(cè)定

表1為抗血清純化前后效價(jià)對(duì)比結(jié)果。由表1可以看出，純化前后血清效價(jià)均可以達(dá)到1︰10 000以上，采用BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)純化后抗體質(zhì)量濃度為3 g/L。分裝，凍存，備用。

表1 前后效價(jià)對(duì)比結(jié)果

2.2 雙抗夾心ELISA最佳實(shí)驗(yàn)條件的確定

方陣滴定法確定的雙抗夾心ELISA的最佳實(shí)驗(yàn)條件為：每孔100 μL質(zhì)量濃度為1 mg/L包被抗體，37℃1 h包被酶標(biāo)板；pH 8.0 TBST洗板3次，每次間隔3 min；200 ml每孔1%BSA 37℃0.5 h封閉；洗板3次；加抗原或標(biāo)準(zhǔn)品37℃1 h，每孔100 μL；洗板5次；酶標(biāo)抗體1︰3000稀釋，每孔100 μL（37℃，1 h）；洗板5次；加TMB底物溶液12 min；濃度為2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀450 nm（主）及630 nm（輔）的雙波長(zhǎng)讀取OD值。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

表2為sIgA ELISA檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)表2的sIgA ELISA檢測(cè)數(shù)據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，該曲線為4參數(shù)Logistic擬合；方程:y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D；A=2.10897；B=-1.63730；C=371.61047；D=0.04871；r2=0.99689。從結(jié)果可以看出：最低檢測(cè)限15.625 μg/L；檢測(cè)范圍15.625～1 000 μg/L。

表2 sIgA ELISA檢測(cè)

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

表3為特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表3可以看出，陽(yáng)性O(shè)D450nm值與這4種蛋白的OD450nm值的比值均大于2.0，說(shuō)明本研究建立的ELISA方法不與這幾種蛋白反應(yīng)，有較好的特異性。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件中的隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)資料的S–N–K方差分析方法進(jìn)行分析：批間比較，F(xiàn)=0.487,P=0.673＞0.05；批內(nèi)比較，F(xiàn)=2.16,P=0.259＞0.05,二者差異均無(wú)顯著意義。說(shuō)明建立的雙抗夾心ELISA方法在批內(nèi)和批間檢測(cè)同一樣品時(shí)差異不顯著。根據(jù)公式CV=S/X×100%,計(jì)算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于10%?？梢?jiàn)用該方法檢測(cè)樣品具有較好的重復(fù)性。

表3 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表4為穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表4可以看出，放置37℃（72 h）后所測(cè)sIgA質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本不變，根據(jù)《中國(guó)生物制品檢定規(guī)程》:一般37℃72 h破壞，與4℃放置相比較，讀值下降不超過(guò)20%，認(rèn)為其效期在6個(gè)月左右。由此可以斷定本實(shí)驗(yàn)具有較好的穩(wěn)定性。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 實(shí)際牛初乳粉樣本的檢測(cè)

表5為牛初乳粉樣本檢測(cè)結(jié)果。分別以A方法和B方法檢測(cè)隨機(jī)抽取的50個(gè)牛初乳粉樣，依據(jù)表5所得數(shù)據(jù)做圖，結(jié)果如圖2所示。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：分別對(duì)兩種方法所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行F和t檢驗(yàn)。置信度為95%時(shí)F計(jì)算＜F表，這兩種檢測(cè)方法的精密度無(wú)顯著性差異。再進(jìn)行t檢驗(yàn)：查t值表，f=48，95%置信度時(shí)t計(jì)算＜t表，故這兩種方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。兩種方法的檢出符合率為92%。

表5 牛初乳粉樣本檢測(cè)結(jié)果

圖2 A方法與B方法的比較

3 討論

影響ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素很多，需要加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在本實(shí)驗(yàn)中每批測(cè)試均須用一系列不同質(zhì)量濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品，在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋的最適比例可以直接影響到檢測(cè)樣本中sIgA質(zhì)量濃度的最終檢出值，因此選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線的最適稀釋比例對(duì)于定量檢測(cè)非常重要[10]。本研究所測(cè)的sIgA屬于大分子量物質(zhì)，故選擇的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍較寬，曲線最高點(diǎn)的吸光度接近2.0。以檢測(cè)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各質(zhì)量濃度的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。所以最后所確定的標(biāo)準(zhǔn)品的最適稀釋比例應(yīng)落在這個(gè)區(qū)域中。基于以上原因，本研究最后確定的最佳稀釋質(zhì)量濃度為1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.625 μg/L。

目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有定量檢測(cè)牛初乳中sIgA的標(biāo)準(zhǔn)方法，本研究選擇雙抗夾心ELISA作為檢測(cè)牛初乳中sIgA的方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏性高、有較好的重復(fù)性、結(jié)果判斷較客觀。為檢測(cè)工業(yè)產(chǎn)品中sIgA的含量提供了參考。

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Establishment of a sandwich ELISA for quantitive measurement of sIgA

ZHU Hong-yan1,ZHAO Hong-yu1,ZHOU Sheng-hua1,GAO Xue-jun2
1.Heilongjiang Kanpure biotechnology Co.Ltd.，Harbin 150000；2.Key Laboratory of Dairy Science Ministry of Education Northeast Agricultural University,Harbin 150030，China）

To establish an effective ELISA mathod for the determination of bovine colostrum sIgA.Rabbit was immunized by bovine colostrum sIgA to obtain the antiserum.Useing the purified antiserum as coating antibody.All the anti-sIgA were labeled with horseradish peroxidase by sodium oxidation method,and take the HRP labeled anti-sIgA for labeled antibody.The optimal concentrations of ELISA were defined by titration.For speciticity reproducibility and sensitivity experiment and measured the sIgA levels of bovine colostrum with this assay.Results a sandwich ELISA assay for detecting sIgA in bovine colostrum was established successfully.The assay result was linear over a concentration range of 15.625～1 000 μg/L with a limit of detection(LOD)of 15.625 μg/L.The coefficients of variation was 4.8%within assay and 6.5%between assay.

ELISA，sIgA，measurement

TS252.7

A

1001-2230（2011）03-0050-03

2010-11-08

朱洪艷（1983-），女，本科，主要從事蛋白純化研究。通訊作者：趙紅宇