韓巍巍，Schaffrath M，Holze V，Pollow K，Seufert R，童曉文

(1.同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院婦保中心，上海 200065;2.德國美因茨大學(xué)醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，德國美因茨 55101)

自1978年第1例試管嬰兒誕生以來，輔助生殖技術(shù)發(fā)展迅速，目前已有上百萬的患者成功孕育了胎兒。隨著年齡的增長，卵巢儲備(卵巢內(nèi)原始卵泡的數(shù)量和質(zhì)量)降低，試管嬰兒(in vitro fertilization，IVF)的成功率逐漸下降?？姑缋占に?anti-Müllerian hormone，AMH)被認(rèn)為是抑制始基卵泡的募集和早期生長卵泡發(fā)育的重要因子之一。

為了研究控制性超排卵過程中血清與卵泡液中AMH水平對治療反應(yīng)性的預(yù)測價值，本研究檢測了促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin-releasing hormone-agonist，GnRH-a)長方案以及GnRH拮抗劑聯(lián)合方案治療不同階段血清和卵泡液中AMH水平，分析其與控制性超排卵治療后各項臨床指標(biāo)的相關(guān)性。探討AMH作為卵巢反應(yīng)性的一種新的監(jiān)測指標(biāo)的可能性及其對控制性超排卵用藥的指導(dǎo)作用。

1 資料與方法

1.1 控制性超排卵

參與實驗的53例患者在德國美因茨大學(xué)醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心接受ICSI治療。采用GnRH-a長方案進行控制性超排卵治療的共40例，采用GnRH拮抗劑聯(lián)合方案的共13例。53例共分為4組:沒有胚胎植入組(6例)、胚胎種植失敗組(34例)、生化妊娠組(5例)、臨床妊娠組(8例)。測定患者血清及卵泡液中 AMH、E2、孕酮(progestone，P)水平。所有患者均簽署參與治療及實驗的知情同意書，本次實驗研究獲得美因茨大學(xué)道德委員會的批準(zhǔn)。

在GnRH-a長方案促排卵過程中，在治療前一周期黃體中期(第18～21天)給予長效GnRH-a進行降調(diào)節(jié)，當(dāng)完全降調(diào)節(jié)達到時，即血清E2≤50 pg/ml，第2天開始給予重組卵泡刺激素(recombinant FSH，rFSH)。在GnRH拮抗劑聯(lián)合方案中，在月經(jīng)第2天給予rFSH，治療第7天開始應(yīng)用GnRH拮抗劑。rFSH的初始劑量為150～300 IU/d(根據(jù)年齡、體質(zhì)量指數(shù)、既往促排卵治療反應(yīng)決定初始劑量)。通過B型超聲檢查和血E2的測定，監(jiān)測卵泡發(fā)育情況并調(diào)整rFSH的劑量。當(dāng)B超監(jiān)測優(yōu)勢卵泡≥18 mm，或有兩個卵泡≥17 mm時，注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)5000～10000 IU，促使卵泡成熟。34～36 h后，在靜脈麻醉狀態(tài)，B超引導(dǎo)下進行穿刺取卵術(shù)，并立即在顯微鏡下取出卵細(xì)胞，移到含胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取卵后4～6 h，MⅡ期的卵子(出現(xiàn)第一極體)行 ICSI，成功后置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱。取卵16～18 h后出現(xiàn)兩個原核和兩個極體，標(biāo)志體外受精成功。取卵3 d后對受精卵細(xì)胞數(shù)量、核外碎片程度，以及卵裂球?qū)ΨQ均勻程度對受精卵進行評分，選取2～3個受精卵植回患者體內(nèi)。取卵14 d后檢測血-HCG，陽性為生化妊娠。胚胎種植6周后B超檢測到宮內(nèi)孕囊、胚芽和原始心管搏動，診斷為臨床妊娠。在取卵后對患者給予孕酮(600 mg/d)支持，如果確定為妊娠，繼續(xù)補充孕酮到第10周，自第10周起減少劑量為400 mg/d，繼續(xù)補充至第12周。

1.2 血清和卵泡液中激素水平測定

在GnRH-a長方案促排卵治療的40例患者中，rFSH應(yīng)用第2天抽取靜脈血5 ml。在全部53例患者中，OPU當(dāng)天抽取靜脈血5 ml，并收集優(yōu)勢卵泡的卵泡液。標(biāo)本穩(wěn)定于室溫20 min后，3000 r/min離心10 min，離心半徑6 cm，吸出上清液裝入無菌試管置入－20℃冰箱凍存?zhèn)錂z。AMH ELISA試劑盒用來檢測AMH含量。應(yīng)用自動酶免疫分析儀檢測E2、P含量。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

53例患者的臨床資料，見表1。體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、基礎(chǔ) FSH、rFSH 用量、受精率在4組間無顯著性差異。臨床妊娠組的患者年齡顯著低于沒有臨床妊娠組(P=0.017)。年齡與獲卵數(shù)呈明顯負(fù)相關(guān)(總獲卵數(shù):P＜0.001，r=－0.535;MⅡ成熟卵數(shù):P ＜0.001，r= －0.470)。

表1 患者的一般資料及接受促排卵治療后的各項臨床指標(biāo)Tab.1 Comparison of clinical and pretreatment parameters in undergoing ovarian stimulation

2.2 血清及卵泡液中各項激素水平比較

53例患者血清及卵泡液中各項激素檢測結(jié)果見表2。在GnRH-a長方案治療組與GnRH拮抗劑聯(lián)合方案治療組，OPU當(dāng)天血清AMH水平無顯著性差異(GnRH-a長方案組:1.1 ±1.3 ng/ml，GnRH拮抗劑聯(lián)合方案組:0.7 ±0.6 ng/ml，P=0.341)，卵泡液中AMH水平在兩組間表達也無明顯差異(GnRH-a長方案組:2.1 ±2.1 ng/ml，GnRH 拮抗劑聯(lián)合方案組:1.6 ±0.8 ng/ml，P=0.378)。

2.3 AMH水平與臨床各項指標(biāo)的相關(guān)性

AMH水平與各項指標(biāo)相關(guān)性見表3，GnRH-a長方案促排卵治療中，治療初始血清AMH水平與患者年齡、總rFSH用量呈負(fù)相關(guān)，與獲卵總數(shù)、成熟卵數(shù)呈正相關(guān)。治療初始血清AMH水平與E2水平呈正相關(guān)(P=0.027，r=0.329)，與 P 水平無明顯相關(guān)性。

表2 血清及卵泡液中各項激素水平Tab.2 Comparison of follicular fluid and serum concentrations of hormones in undergoing ovarian stinulation

表3 血清及卵泡液中AMH水平與臨床各項指標(biāo)的相關(guān)性Tab.3 Correlation between hormone levels and clinical parameters by statistical analysis

53例患者OPU當(dāng)天血清AMH水平與患者年齡、總rFSH用量呈負(fù)相關(guān)，與總獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)呈正相關(guān)。OPU當(dāng)天血清AMH水平與E2水平呈正相關(guān)(P=0.012，r=0.364)，與 P 水平無明顯相關(guān)性。OPU當(dāng)天血清E2水平與獲卵數(shù)呈正相關(guān)(總獲卵數(shù):P＜0.001，r=0.682;成熟卵數(shù):P＜0.001，r=0.667)。

OPU當(dāng)天卵泡液中AMH水平與患者年齡、總rFSH用量呈負(fù)相關(guān)，與總獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)呈正相關(guān)。卵泡液中AMH水平與OPU當(dāng)天血清AMH水平呈正相關(guān)(P ＜0.001，r=0.570)。

3 討 論

目前，全球不孕夫婦正呈逐年上升趨勢，不孕不育癥的發(fā)病率為15% ～20%。1978年，第1例體外受精的嬰兒在倫敦誕生，輔助生殖技術(shù)迅速發(fā)展，并廣泛應(yīng)用于不孕癥的臨床治療方面。今天，在輔助生殖技術(shù)中廣泛應(yīng)用控制性超排卵技術(shù)(controlled ovarian hyperstimulation，COH)。其理想的條件包括:用藥物對卵巢進行超常的刺激以得到適當(dāng)多數(shù)目的卵子，得到高質(zhì)量的卵子;用藥后體內(nèi)的內(nèi)分泌環(huán)境及子宮內(nèi)膜條件要適合胚胎的著床、生長、發(fā)育;盡量減少副作用如卵巢過度刺激綜合征;整個過程可以被人們所調(diào)控。在治療過程中，卵巢對促性腺激素的反應(yīng)是臨床成功的關(guān)鍵因素，因此在患者進行昂貴的輔助生殖治療(assisted reproductive technology，ART)前評估卵巢儲備功能，在治療過程中監(jiān)測，預(yù)測卵巢反應(yīng)性，有重要的臨床意義，可以幫助臨床醫(yī)生篩選患者，制定個體化的治療方案，減少卵巢過度刺激綜合征和卵巢低反應(yīng)的發(fā)生，獲得最佳的治療結(jié)果。

AMH又稱苗勒抑制物質(zhì)(Müllerian inhibiting substance，MIS)，是轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor β，TGF-β)家族的成員，由兩個相同的70 kb亞基組成的二聚糖蛋白。在對動物［1］及人類［2-3］的研究中發(fā)現(xiàn)，AMH僅由性腺合成。它主要表達于胎兒的睪丸組織，起促進男性生殖道的分化作用。出生后，在女性，AMH由卵巢顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，在新生兒期體內(nèi)幾乎測不到，到性成熟后達最高水平，絕經(jīng)后又消失。在自然月經(jīng)周期中，募集的卵泡少，發(fā)現(xiàn)AMH水平在整個月經(jīng)周期中波動極小，呈相對穩(wěn)定狀態(tài)［4］。近期的研究表明AMH是可以預(yù)測卵巢儲備及控制性超排卵治療后卵巢反應(yīng)的一個重要因子［5-7］。在對雌鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，AMH抑制始基卵泡的募集，阻止卵泡池的消耗［8］，同時還可抑制卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)依賴性的竇前卵泡生長［7］。Weenen證實人類卵巢中AMH的表達類似于嚙齒目動物［9］。與其他反應(yīng)卵泡狀態(tài)的因子不同，AMH僅有卵巢顆粒細(xì)胞分泌。研究表明竇卵泡計數(shù)與月經(jīng)第3天血清AMH水平密切相關(guān)，超過與基礎(chǔ)FSH、抑制素B(inhibin B，INHB)、E2(estradiol)的相關(guān)程度。另外，在促排卵治療過程中，血清AMH水平逐漸下降，可能反映了由于超排卵而引起小竇卵泡數(shù)目的急劇減少，肯定了較大卵泡缺乏AMH的表達［10］。

卵巢儲備隨著婦女的年齡增長而下降，卵巢皮質(zhì)區(qū)卵泡逐漸減少。相關(guān)研究［11］對年齡≥41歲的接受IVF/ICSI治療的431例患者進行分析，結(jié)果表明41～43歲患者每一次采卵的成功分娩率為2%～7%，≥44歲患者無1例成功分娩，≥45歲患者無1例成功妊娠。Templeton證實年齡可以預(yù)測IVF的結(jié)局［12］。本研究也發(fā)現(xiàn)，患者年齡與總獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)呈負(fù)相關(guān)，顯然年齡是影響ART治療結(jié)局的一個重要因素。

研究顯示，月經(jīng)周期第3天AMH水平可以預(yù)測促排卵治療的卵巢反應(yīng)性及卵巢儲備［5-6，13］?；A(chǔ) AMH 水平與卵巢反應(yīng)性呈正相關(guān)［6，14-15］，與獲卵數(shù)呈正相關(guān)，且相關(guān)性明顯高于基礎(chǔ)AMH水平與基礎(chǔ)FSH、抑制素B的相關(guān)性［16］?？刂菩猿怕堰^程中，AMH的動態(tài)變化與自然周期不同［17］。促排卵過程中AMH水平可以更好地預(yù)測卵巢反應(yīng)性［18］。Penarrubia 等［19］證實，GnRH-a 長方案促排卵過程中，初始階段血清AMH水平在周期取消組明顯偏低，輔助生殖治療第5天的AMH水平比基礎(chǔ)AMH水平能更好地預(yù)測周期取消率。控制性超排卵中AMH水平能夠反應(yīng)卵細(xì)胞的質(zhì)量和卵巢反應(yīng)性［20］。本研究中，GnRH-a長方案控制性超排卵過程中，早卵泡期血清AMH水平與患者年齡、總rFSH用量呈負(fù)相關(guān)，與總獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)呈正相關(guān)。小竇卵泡的AMH含量明顯高于排卵前卵泡AMH含量，表明血清AMH水平主要反應(yīng)小竇卵泡的數(shù)量［21］。在COH過程中，多個卵泡發(fā)育，血清AMH水平逐漸下降，可能反應(yīng)了由于促排卵導(dǎo)致的小竇卵泡數(shù)量的進行性下降［22］。La Marca等［23］發(fā)現(xiàn)，在女性生育后期，血清 AMH 水平下降，在絕經(jīng)期，即使用十分精密的測量方法，仍無法檢測到AMH水平。這些證據(jù)更加說明AMH可以預(yù)測卵巢儲備。與基礎(chǔ)AMH水平相比，COH早卵泡期的血清AMH水平，在外源性促性腺激素作用下，對卵巢反應(yīng)性有更好的預(yù)測價值。

本研究中，在GnRH-a長方案與GnRH拮抗劑聯(lián)合方案促排卵治療中，OPU當(dāng)天AMH水平無明顯差異，提示在GnRH-a長方案與GnRH拮抗劑聯(lián)合方案促排卵過程中，卵泡發(fā)育的微環(huán)境，AMH以及其他激素的分泌無明顯差別［24］。本研究中，OPU當(dāng)天血清AMH水平與總獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)呈正相關(guān)。Wunder等［25］也得出相同的結(jié)論。相關(guān)研究對33名GnRH-a長方案+ICSI治療患者進行研究，發(fā)現(xiàn)在黃體中期，促排卵早卵泡期，以及排卵期血清AMH水平與獲卵數(shù)呈正相關(guān)，黃體中期與早卵泡期的AMH水平能更好的預(yù)測臨床妊娠［26］。本研究發(fā)現(xiàn)OPU當(dāng)天卵泡液中AMH水平與年齡、總rFSH用量呈負(fù)相關(guān)，與總獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)呈正相關(guān)，并且與當(dāng)天血清AMH呈正相關(guān)。最近一項研究［25］表明，在COH治療受孕組，OPU當(dāng)天卵泡液中AMH水平明顯高于未受孕組。Takahashi等［27］也證實，接受IVF治療受精成功組卵泡液中AMH水平明顯高于未成功組。

體外受精-胚胎移植技術(shù)是一項有創(chuàng)的，昂貴的治療，接受治療患者同時承受生理和心理上的壓力。制定個性化的治療方案，在治療過程中監(jiān)測卵巢反應(yīng)，及時評估卵巢不良反應(yīng)的發(fā)生有重要意義。目前，控制性超排卵治療過程中常規(guī)采用B超、血清E2水平監(jiān)測卵巢反應(yīng)性，但仍存在較高的周期取消率和卵巢反應(yīng)低下發(fā)生率。通過本研究得出的結(jié)論，在控制性超排卵治療過程早卵泡期血清AMH水平與卵巢反應(yīng)性(總獲卵數(shù)和成熟卵數(shù))呈正相關(guān)，檢測治療過程早卵泡期血清AMH水平有助于更加準(zhǔn)確的評估卵巢反應(yīng)性，預(yù)測卵巢反應(yīng)低下的發(fā)生，有助于調(diào)整治療方案，調(diào)整rFSH使用劑量，達到更好的治療效果。因卵泡穿刺當(dāng)天血清和卵泡液AMH水平，與獲取卵子數(shù)量，成熟卵數(shù)均有顯著相關(guān)性，考慮檢測卵泡液中AMH水平操作較復(fù)雜，可以僅檢測OPU當(dāng)天血清AMH水平，作為參考條件之一選擇胚胎植入數(shù)量，有助于避免多胎妊娠的發(fā)生。

［1］Vigier B，Picard JY，Tran D，et al.Production of anti-Müllerian hormone:another homology between Sertoli and granulosa cells［J］.Endocrinology，1984，114:1315-1320.

［2］Rey R，Lukas C，Lasala C，et al.AMH/MIS:what we know already about the gene，the protein and its regulation［J］.Mol Cell Endocrinol，2003，211:21-31.

［3］Di Clemente N，Ghaffari S，Pepinsky R，et al.A quantitative and interspecific test for biological activity of anti-Müllerian hormone:the fetal ovary aromatase assay［J］.Development，1992，114:721-727.

［4］Tsepelidis S，Devreker F，Demeestere I，et al.Stable serum levels of anti-Müllerian hormone during the menstrual cycle:a prospective study in normo-ovulatory women［J］.Hum Reprod，2007，22:1837-1840.

［5］Seifer DB，Maclaughlin DT，Christian BP，et al.Early follicular serum müllerian-inhibiting substance levels are associated with ovarian response during assisted reproductive technology cycles［J］.Fertil Steril，2002，77:468-471.

［6］Van Rooij IA，Broekmans FJ，te Velde ER，et al.Serum anti-Müllerian hormone levels:a novel measure of ovarian reserve［J］.Hum Reprod，2002，17:3065-3071.

［7］Gruijters MJG，Visser JA，Durlinger ALL，et al.Anti-Müllerian hormone and its role in ovarian function［J］.Mol Cell Endocrinol，2003，211:85-90.

［8］Durlinger ALL，Visser JA，Themmen APN.Regulation of ovarian function:the role of anti-Müllerian hormone［J］.Reproduction，2002，124，601-609.

［9］Weenen C，Laven JSE，Von Bergh ARM，et al.Anti-Müllerian hormone expression pattern in the human ovary:potiential implications for initial and cyclic follicle recriutment［J］.Mol Hum Reprod，2004，10:77-83.

［10］Feyereisen E，Mendez LDH，Taieb J，et al.Anti-Müllerian hormone:clinical insights into a promising biomarker of ovarian follicular status［J］.Reprod Biomed Online，2006，12:695-703.

［11］Ron-El R，Raziel A，Strassburger D，et al.Outcome of assisted reproductive technology in women over the age of 41［J］.Fertil Steril，2000，74:471-480.

［12］Templeton A，Morris JK，Parslow W.Factors that affect outcome of in-vitro fertilisation treatment［J］.Lancet，1996，348:1402-1406.

［13］De V，Laven JSE，De JFH，et al.Anti-müllerian hormone serum levels:a putative marker for ovarian aging［J］.Fertil Steril，2002，77:357-362.

［14］Tremellen KP，Kolo M，Gilmore A，et al. Anti-Müllerian hormone as a marker of ovarian reserve［J］.Aust NZ J Obstet Gynecol，2005，45:20-24.

［15］Ebner T，Sommergruber M，Moser M，et al.Basal level of anti-Müllerian hormone is associated with oocyte quality in stimulated cycles［J］.Hum Reprod，2006，21，2022-2026.

［16］Muttukrishna S，McGarrigle H，Wakim R，et al.Antral follicle count，anti-Müllerian hormone and inhibin B:predictors of ovarian response in assisted reproductive technology?［J］.Brit J Obstet Gynaecol，2005，112:1384-1390.

［17］La Marca A，Volpe A.Anti-mullerian hormone(AMH)in female reproduction:is measurement of circulating AMH a useful tool?［J］.Chin Endocrinol，2006，64:603-610.

［18］Bukman A，Heineman MJ.Ovarian reserve testing and the use of prognostic models in patients with subfertility［J］.Hum Reprod Update，2001，7:581-590.

［19］Penarrubia J，F(xiàn)abregues F，Manau D，et al.Basal and stimulation day 5 anti-Müllerian hormone serum concentrations as predictors of ovarian response and pregnancy in assisted reproductive technology cycles stimulated with gonadotropin-releasing hormone agonistgonadotropin treatment［J］.Human Reproduction，2005，20:915-922.

［20］Fanchin R，Louafi N，Méndez LDH，et al.Per-follicle measurements indicate that anti-Müllerian hormone secretion is modulated by the extent of follicular development and luteinization and may reflect qualitatively theovarian follicular status［J］.Fertil Steril，2005，84:167-173.

［21］Andersen CY，Byskov AG.Estradiol and regulation of anti-Müllerian hormone， inhibin-A， and inhibin-B secretion:analysis of small antral and preovulatory human follicles'fluid［J］.J Chin Endocrinol Metab，2006，91:4064-4069.

［22］Fanchin R，Schonauer LM，Righini C，et al.Serum anti-Müllerian hormone dynamic during controlled ovarian hyperstimulation［J］.Hum Reprod，2003，18:328-332.

［23］La Marca A，De Leo V，Giulini S，et al.Anti-Müllerian hormone in premenopausal women and after spontaneous or surgically induced menopause［J］.J Soc Gynecol Investig，2005，12:545-548.

［24］Lee JR，Kim SH，Kim SM，et al.Follicular fluid anti-Müllerian hormone and inhibin B concentrations:comparison between gonadotrpin-releasing hormone(GnRH)agonist and GnRH antagonist cycles［J］.Fertil Steril，2008，89:860-867.

［25］Wunder DM，Guibourdenche J，Birkhauser MH，et al.Anti-Müllerian hormone and inhibin B as predictors of pregnancy after treatment by in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection ［J］. Fertil Steril，2008，90:2203-2210.

［26］Elgindy EA， El-Haieg DO， El-Sebaey A. Anti-Müllerian hormone:correlation of early follicular，ovulatory and midluteal levels with ovarian response and cycles outcome in intracytoplasmic sperm injection patients［J］.Fertil Steril，2008，89:1670-1676.

［27］Takahashi C， Fujito A， Kazuka M， et al. Anti-Müllerian hormone subatance from follicular fluid is positively associated with success in o ocyte fertilization during in vitro fertilization［J］.Fertil Steril，2008，89:586-591.