高 哲，陳 建

(浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院藥劑科，杭州 310003)

固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是繼微乳、脂質(zhì)體、聚合物納米粒之后，發(fā)展起來的一種新型毫微粒類給藥系統(tǒng)。它具有物理穩(wěn)定性高、可以控制藥物的釋放、避免藥物的降解或泄漏的優(yōu)勢，毒性低、生理相容性好，是一種很有發(fā)展前景的藥物給藥系統(tǒng)［1-3］。但SLN在體內(nèi)對單核細胞吞噬系統(tǒng)(mononuclear phagocyte system，MPs)有趨向性，使其在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system，RES)的分布增加，體內(nèi)循環(huán)時間減少［4］。有研究發(fā)現(xiàn)通過聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾SLN可以提高SLN在體內(nèi)的循環(huán)時間，減慢消除［5］。然而對于口服 PEG修飾 SLN后對胃腸道轉(zhuǎn)運的影響還未見報道。本研究通過合成熒光標記不同含量和聚合度PEG-SLN，以SD大鼠為模型，檢測口服PEG-SLN后在體內(nèi)濃度變化，以期系統(tǒng)闡明PEG對SLN在胃腸道轉(zhuǎn)運和體內(nèi)消除的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器

硬脂酸(stearic acid，SA，上海化學試劑采購供應站)，聚乙二醇-硬脂酸酯(PEG-SA，Kasei Kogy Co.，Japan)，硬脂胺-異硫氰基熒光素嫁接物(Octadecylamine-fluorescein isothiocyanate，ODA-FITC，自備，制備方法見參考文獻［6］)，SD大鼠(浙江大學醫(yī)學院實驗動物中心)，其他溶劑和試劑均為色譜純或分析純。熒光分光光度計(F-2500，HITACHI Co.，Japan)，微粒粒度及表面電位分析儀(Zetasizer 3000HS，Malvern，UK)，冷凍干燥機(Freezone 2.5 plus，Labconoco Co.，USA)，核 磁 共 振 儀 (AC-80， BrukerBiospin，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 熒光標記PEG-SLN的制備 精密稱取硬脂酸60 mg，ODA-FITC 熒光嫁接物4.8 mg，PEG 2000-SA(使與硬脂酸的比例分別為 0.67%、1.3%、2.0%、2.6%，mol/mol)，或不同聚合度的PEG-SA適量(使PEG1300-SA、PEG 2000-SA和PEG2700-SA與硬脂酸的比例均為1.3%，mol/mol)，加入無水乙醇6 mL，超聲使完全溶解。以蒸餾水為分散介質(zhì)，在70℃水浴、400 r/min機械攪拌條件下，將有機相迅速注入60 ml分散介質(zhì)中，得PEG修飾熒光標記SLN分散液。以鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.2，使納米粒絮凝，微孔濾膜過濾得到納米粒沉淀。將納米粒沉淀再分散至3 ml 0.1% 泊洛沙姆188溶液中，探頭超聲處理，得到熒光標記不同修飾比例PEG2000-SLN和不同聚合度PEG-SLN再分散液。

1.2.2 PEG-SLN核磁共振試驗和修飾率 取適量PEG-SLN溶于氘代氯仿中，作核磁共振檢測得PEGSLN的核磁共振氫譜。對PEG特征1H峰(化學位移3.7)和 CH3特征1H峰(化學位移0.8)進行積分，并根據(jù)公式(1)、(2)計算PEG含量摩爾百分比和修飾率:

1.2.3 PEG-SLN粒徑和 Zeta電位 取 PEG-SLN再分散液，以蒸餾水稀釋400倍，用微粒粒度與Zeta電位測定儀測定平均粒徑和Zeta電位。

1.2.4 PEG-SLN血樣測定標準曲線 取適量PEG-SLN加至血液(含有肝素溶液抗凝)中形成脂質(zhì)濃度為200 μg/ml的分散液。移取適量，用全血稀釋至脂質(zhì)濃度為 5、10、25、50、100 μg/ml的標準分散液，水浴37℃孵育5 min，加入同等體積乙腈，漩渦振蕩3 min混勻，8 000 r/min，離心半徑6 cm，離心10 min后取上清液，熒光分光光度法(Ex:495 nm，Em:514 nm，slit:5 nm)測定，根據(jù)熒光值繪制標準曲線。

1.2.5 PEG-SLN口服后胃腸道轉(zhuǎn)運和體內(nèi)消除取SD大鼠若干，隨機分為兩組，使每組大鼠為10只。實驗前禁食12 h。按照150 mg PEG-SLN/kg的劑量分別給各實驗組大鼠灌胃不同比例修飾(PEG2000-SA，0.67%、1.3%、2.0%，mol/mol)和不同聚合度(PEG1300-SA、PEG2000-SA，PEG2700-SA，1.3%，mol/mol)PEG修飾的SLN再分散液，分別于0、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h 從尾靜脈取血，肝素抗凝，按照1.2.4 法分析測定。

2 結(jié) 果

PEG-SLN核磁共振氫譜，見圖1。由圖可見，經(jīng)PEG(Mw 1 300、2 000、2 700)修飾后的 SLN 圖譜中同時有硬脂酸分子中基團特征峰(化學位移0.8)和PEG-SA分子中(CH2CH2O)基團特征峰(化學位移3.7)，證明PEG已修飾到SLN表面。

不同投量和聚合度PEG在SLN中修飾率計算結(jié)果見圖2。采用溶劑擴散法制備對PEG-SA具有較高的修飾率。由圖可見，PEG投量提高，PEG修飾率穩(wěn)定為72%，當PEG投量增加到2.6%，mol/mol時，修飾率下降至58%，說明采用溶劑擴散法制備SLN對PEG-SA的包載有飽和趨勢。PEG聚合度提高，修飾率略有下降，可能因為PEG的聚合度越大，空間位阻和在水中的運動黏度也就越大，不利于SLN對PEG的包裹。

以溶劑擴散法制備的PEG-SLN，粒徑和電位考察結(jié)果見表1。由表可見，隨著制備處方中 PEG 2000-SA用量的增加，SLN粒徑從200.3 nm逐漸增至306.3 nm。當PEG聚合度(Mw)逐漸變大，PEGSLN粒徑?jīng)]有發(fā)生明顯變化。SLN未經(jīng)PEG修飾的粒徑約為200 nm，PEG鏈長的改變對SLN粒徑影響不明顯。SLN的粒徑主要由所選用的脂質(zhì)材料和制備方法本身性質(zhì)所決定。

各組的Zeta電位都也比較接近，約為－24 mv左右。

表1 不同修飾比例、不同聚合度PEG-SLN的粒徑和Zeta電位Tab.1 Different modification proportion，different degree of polymerization PEG-SLN particle size distribution and Zeta potential

PEG修飾的SLN在血液中的平均回收率為32.1%，RSD＜15%，具有良好的重現(xiàn)性。精密度測定RSD＜15%，該血樣處理方法滿足后續(xù)試驗要求。

PEG-SLN在血樣中標準曲線考察結(jié)果。由圖可見，PEG-SLN在血樣中的線性方程分別為Y=3.56 x －0.18(PEG2000-SA，0.67%，mol/mol)、Y=4.62x+8.11(PEG2000-SA，1.3%，mol/mol)、Y=6.96x － 7.51(PEG2000-SA，2.0%，mol/mol)、Y=7.06x+7.61(PEG1300-SA，1.3%，mol/mol)和 Y=10.68x+1.84(PEG2700-SA，1.3%，mol/mol)。線性良好(r＞0.99)，線性范圍均為5 ～100 μg/ml。

大鼠口服不同含量(0.67%、1.3%、2.0%，mol/mol)PEG修飾SLN后的體內(nèi)濃度變化曲線見圖3。由圖可見，PEG含量越低，口服1～2 h后SLN濃度越高，說明PEG含量提高不利于SLN的胃腸道吸收。因為PEG含量增加，覆蓋于SLN表面的PEG側(cè)鏈越多，越不利于SLN的淋巴轉(zhuǎn)運，使吸收速率降低。至8 h，PEG含量越高，其體內(nèi)的消除速度越慢，說明PEG含量的提高有助于提高SLN的體循環(huán)時間。

大鼠口服不同聚合度(Mw 1 300、Mw 2 000、Mw 2 700)PEG修飾SLN后的體內(nèi)濃度變化曲線見圖4。由圖可見，PEG聚合度越大，在口服后1～4 h，SLN濃度越小，說明PEG聚合度越大對SLN在胃腸道內(nèi)吸收有阻礙。至12 h，PEG聚合度越大，SLN消除越慢，表明PEG聚合度變大有利于PEG-SLN的“隱匿”。

3 討 論

本研究采用了一種新型的合成熒光素嫁接物——硬脂胺-異硫氰基熒光素作為熒光標記物。在N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide，DMF)中，硬脂胺的氨基能與異硫氰基熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)發(fā)生加成反應，形成 ODA-FITC。由于硬脂胺-FITC的疏水鏈和硬脂酸性質(zhì)相近，具有較強親和力，使兩者能夠緊密結(jié)合，不易分離，是理想的硬脂酸SLN熒光標記物［6］。

通過水性溶劑擴散法制備得到的PEG-SLN，其平均粒徑為200.3 ～306.3 nm，表面電位約為 －24 mv，與未經(jīng)修飾的SLN相比，變化不顯著。由于PEG親水性較強，故在溶劑擴散法制備過程中更易趨向于極性較大的水性溶劑而富集于脂質(zhì)表面。經(jīng)核磁共振考察確認PEG成功嫁接到SLN表面。當PEG-SA的投量在12 wt%以下時，PEG修飾率穩(wěn)定在72%，說明通過溶劑擴散法制備PEG-SLN有效而簡便。

先前的研究已發(fā)現(xiàn)，PEG-SLN體內(nèi)的循環(huán)時間較未經(jīng)PEG修飾的SLN大大延長，具有長循環(huán)作用，而SLN主要通過淋巴吸收途徑進入體循環(huán)［5］。外源性脂質(zhì)通常在小腸內(nèi)水解成脂肪酸和甘油酯，由腸黏膜一些脂蛋白結(jié)合形成乳糜微粒(CM)后，經(jīng)淋巴吸收。脂質(zhì)在淋巴液中的溶解度是影響淋巴轉(zhuǎn)運效率和速度的重要因素［7-8］。PEG作為一種親水性較強的長鏈聚合物，對SLN修飾后使SLN表面親水性增強，不利于SLN對脂蛋白的吸附，使SLN在淋巴液中溶解度降低，阻礙SLN的淋巴轉(zhuǎn)運，導致SLN胃腸道吸收速度下降。PEG的含量越高，聚合度越大，胃腸道的吸收速度越低。

經(jīng)PEG修飾后微粒在體內(nèi)具有長循環(huán)作用，主要與PEG修飾后SLN可以避免調(diào)理素等識別，防止被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的攝取有關(guān)［9］。本研究表明，SLN表面PEG的含量越高，聚合度越大，其干擾蛋白吸附到SLN表面的能力越強，更有效地避免SLN被巨噬細胞吞噬。SLN中PEG含量和聚合度改變對藥物的釋放影響同樣明顯。已有報道，微粒中PEG含量的增大使藥物的前期突釋更為嚴重，釋放的速率更快。主要由于PEG可以在微粒中構(gòu)成一種分子核或分子通道，更有利于藥物的擴散。PEG含量越多，這樣的分子核或分子通道也就越多，則藥物釋放越快［10］。

綜上所述，PEG含量和聚合度提高會減慢SLN在胃腸道內(nèi)吸收，延長SLN體循環(huán)時間，加快藥物的釋放。因而對SLN進行PEG修飾須綜合考慮吸收、藥物釋放以及體內(nèi)循環(huán)時間等多方面因素，根據(jù)實際所載藥物特性，選擇一個最佳PEG聚合度和投量比例。

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