趙星宇，陳旭升，張宏建，張建華*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是由多個(gè)賴氨酸殘基通過α-COOH和ε-NH2連接而成的一種同型氨基酸聚合物[1]，聚合度多為5～35，分子質(zhì)量一般在780～4 600 Da。ε-PL產(chǎn)品為淡黃色粉末，吸濕性強(qiáng)，極易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，熱穩(wěn)定性較好，水溶液可以在100 ℃加熱 30 min 或者在120 ℃條件下加熱20 min不降解[2]。由于其主鏈上存在許多游離氨基，在酸性到弱堿性環(huán)境中表現(xiàn)出多陽離子特性。它對(duì)多種微生物，包括大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、酵母、霉菌和噬菌體均有抑制作用[3-6]。ε-PL 作為一種綠色、安全生物食品防腐劑被廣泛使用[7-8]。

研究表明，ε-PL的合成是在聚賴氨酸合成酶的催化作用下，以L-賴氨酸為前體，以非核糖體多肽合成方式聚合[9]。ε-PL的抑菌性能受其聚合度影響，日本學(xué)者SHIMA等[10]考察了ε-PL的抑菌性能，發(fā)現(xiàn)當(dāng)ε-PL聚合度<9時(shí)，抑菌活性很低，ε-PL聚合度>25時(shí)，其抑菌性能最佳。在劉慶瑞等[11]的研究中，高聚合度ε-PL對(duì)革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)是發(fā)酵產(chǎn)生的ε-PL的1/2 ～1/4；聚合度<20的ε-PL的MIC 值是發(fā)酵產(chǎn)生的ε-PL 的2～4倍，ε-PL聚合度越高越有利于抑制細(xì)菌。KITO等[12]在Streptomycesalbulus細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)了ε-PL降解酶(ε-poly-L-lysine-degrading enzyme，PLD)的存在，他們研究發(fā)現(xiàn)其最適pH值為7.0，在發(fā)酵過程中控制低pH可以避免ε-PL降解，從而積累高聚合度的ε-PL。NISHIKAWA等[13]在ε-PL合成過程中向培養(yǎng)基內(nèi)同時(shí)添加甘油和璜化ε-環(huán)糊精，使得ε-PL分子質(zhì)量由3.5～4.5 kDa減小到2.5 kDa，他們還提出了一種通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中多元醇濃度來控制ε-PL中賴氨酸殘基數(shù)量的方法。現(xiàn)有的對(duì)于ε-PL聚合度控制的研究大多集中在菌株改造和發(fā)酵過程控制等環(huán)節(jié)，通過下游分離工藝來控制商品ε-PL的聚合度卻尚未見報(bào)道。

膜分離技術(shù)是以選擇性透過膜為介質(zhì)，借助于外界能量或化學(xué)位差的推動(dòng)，實(shí)現(xiàn)多組分混合物進(jìn)行分離、分級(jí)、提純以及濃縮富集的技術(shù)，其過程簡(jiǎn)單，無相變，無二次污染且分離系數(shù)大[14-15]。本團(tuán)隊(duì)前期篩選的鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的ε-PL聚合度主要分布在5～35，本研究旨在嘗試通過膜分離技術(shù)，在下游分離提取環(huán)節(jié)部分分離去除低聚合度(<25)ε-PL，提高產(chǎn)品中高聚合度(25～35)ε-PL含量，以提高單位產(chǎn)品的抑菌性能。

1 材料與方法

1.1 材料

ε-PL，江蘇一鳴生物科技有限公司；乙腈(純度≥99%)、甲基橙、NaClO4·H2O等常規(guī)試劑，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)用膜片，泰州星達(dá)膜科技有限公司，主要參數(shù)如表1所示。

表1 膜片主要性能參數(shù)Table 1 Main parameters of membrane

1.2 儀器與設(shè)備

Synder小型超濾系統(tǒng)，泰州星達(dá)膜科技有限公司；PHS3TC pH計(jì)，上海天達(dá)儀器有限公司；UV2100分光光度計(jì)，優(yōu)尼科儀器有限公司；AB204N分析天平，瑞士梅特勒公司；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司。

1.3 ε-PL的分析

ε-PL濃度采用甲基橙比色法確定[16]。ε-PL聚合度通過離子對(duì)色譜[17-18]來測(cè)定。TSKgel ODS-80Ts色譜柱(4.6 mm×250 mm;Tosoh，Tokyo)，流動(dòng)相A：10 mmol/L NaH2PO4、100 mmol/L NaClO4·H2O， 10 mmol/L辛烷磺酸鈉，磷酸調(diào)pH值至2.6。流動(dòng)相B：20 mmol/L NaH2PO4，200 mmol/L NaClO4·H2O，20 mmol/L辛烷磺酸鈉，磷酸調(diào)pH值至2.6，50%(體積分?jǐn)?shù))乙腈。流動(dòng)相梯度：50 ℃，85 min內(nèi)，B從55%線性變化為90%，與A混合，0.4 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm。該色譜條件下不同聚合度的ε-PL的校正因子相近，不同聚合度的ε-PL的含量由歸一化法來定量。

1.4 膜的截留率與透過率

膜的截留率如計(jì)算公式(1)所示：

(1)

式中：C0，原料液中的ε-PL質(zhì)量濃度，g/L；C1，截留液中ε-PL質(zhì)量濃度，g/L；V0、V1，料液、截留液的體積，L。

膜的透過率計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：C2，透過液中ε-PL質(zhì)量濃度，g/L；V2，透過液的體積，L。

1.5 膜通量的測(cè)定

通過測(cè)定一定時(shí)間得到的透過液體積，根據(jù)公式(3)計(jì)算膜通量：

(3)

式中：V，透過液的體積，L；A，膜面積，m2；t，過濾的時(shí)間，h。

1.6 透析過濾

本研究使用的小型膜分離裝置結(jié)構(gòu)如圖1所示。操作方式參考李芳良等[19]的間歇變?nèi)轁B濾。

1.7 ε-PL的抑菌性能

測(cè)定不同ε-PL產(chǎn)品的MIC，比較其抑菌性能[10]。細(xì)菌采用肉湯液體培養(yǎng)基，酵母菌采用YPD 液體培養(yǎng)基，霉菌采用PDA 液體培養(yǎng)基來培養(yǎng)。向每個(gè)試管內(nèi)加入 1 mL稀釋后的ε-PL 溶液和1 mL培養(yǎng)基稀釋的菌液，使細(xì)菌菌液濃度約為 5×105CFU/mL，酵母菌、霉菌終濃度為0.5～2.5×103CFU/mL。其中，細(xì)菌第1～11管ε-PL質(zhì)量濃度分別為 1，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 μg/mL，酵母菌和霉菌第1～11管ε-PL質(zhì)量濃度分別為 1 200、1 100、1 000、900、800、700、600、500、400、200、100 μg/mL。細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)12 h，酵母菌、霉菌于37 ℃培養(yǎng)48 h后，肉眼觀察以完全抑制菌體生長(zhǎng)的最低ε-PL濃度為最小抑菌濃度[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜片截留分子質(zhì)量的選擇

ε-PL等電點(diǎn)約為9，在pH=9的溶液中，ε-PL接近電中性，選擇該pH條件對(duì)料液進(jìn)行分離，可減少ε-PL帶電性在過膜過程中的干擾。選擇pH=9，質(zhì)量濃度為10 g/L的ε-PL水溶液作為待分離料液，在壓力為0.25 MPa的條件下進(jìn)行膜片的預(yù)篩。由圖2-a 可知，在同樣的操作條件下，膜的截留分子質(zhì)量越大，其膜通量越大。膜MT(5 000 Da)對(duì)于ε-PL截留率較低，其他4種膜對(duì)ε-PL的截留率均達(dá)到80%以上。

通過對(duì)不同型號(hào)膜的透過液進(jìn)行聚合度分析(圖2-b)，VT膜的綜合表現(xiàn)最好。VT膜透過液中低聚合度ε-PL含量最高，其低聚合度(<25)ε-PL含量為41.08%，聚合度在25～35的ε-PL含量為58.92%。VT膜標(biāo)定的截留分子質(zhì)量為3 000 Da，而聚合度為25的ε-PL的分子質(zhì)量為3 348 Da，在后續(xù)的研究中，選擇VT膜進(jìn)行研究。

2.2 操作壓力對(duì)高低聚合度ε-PL分離效果的影響

壓力會(huì)影響膜分離過程的體積通量，圖3-a可知體積通量隨著壓力的增加而增加。壓力基本上不會(huì)影響VT膜對(duì)高聚合度的ε-PL的透過率(圖3-b)，但是壓力較小時(shí)，低聚合度ε-PL透過率相對(duì)較高，可見在分離過程中，低聚合度的ε-PL相對(duì)更容易通過膜。但由于循環(huán)液中低聚合度ε-PL的含量很低(17.73%)，且高低聚合度的ε-PL分子質(zhì)量差異并不顯著，因此分離效果并不明顯。由于壓力較低時(shí)膜通量很低，選擇0.25 MPa(約0.25 MPa)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的操作壓力。

2.3 pH對(duì)高低聚合度ε-PL分離效果的影響

VT對(duì)不同pH溶液中的ε-PL存在不同的篩分效果。VT對(duì)ε-PL溶液的截留率隨著pH的增加減少，如圖4-a所示，而體積通量基本上穩(wěn)定。由圖4-b可知，隨著pH增加，透過液中的低聚合度ε-PL比例先增加后減少，在pH=6時(shí)，低聚合度ε-PL含量最高，為75.32%，在等電點(diǎn)附近，pH=9時(shí)，低聚合度ε-PL含量最低，為22.08%。

由圖4-c可知，ε-PL的透過率隨著pH的增加而增加。在pH=3時(shí)，VT對(duì)低聚合度ε-PL透過率為2.89%。當(dāng)料液pH=10時(shí)，對(duì)低聚合度ε-PL透過率為37.51%，高聚合度ε-PL透過率為21.67%。而在pH=6時(shí)，透過液中低聚合度ε-PL比例較高，在該pH下，低聚合度ε-PL透過速率與高聚合度ε-PL相比差值更大，更有利于高低聚合度ε-PL的分離。

2.4 初始進(jìn)料濃度對(duì)高低聚合度ε-PL分離效果的影響

VT膜對(duì)ε-PL的篩分效果受料液濃度影響。體積通量會(huì)隨著料液濃度的增加而降低，越稀的溶液在VT上的透過速率越快，膜對(duì)ε-PL的截留率也隨料液濃度的增加而減小(圖5-a)。進(jìn)料液質(zhì)量濃度為5 g/L的VT透過液中，低聚合度ε-PL的含量?jī)H17.74%，VT膜基本上對(duì)溶液中高低聚合度的ε-PL沒有選擇性。而當(dāng)進(jìn)料液質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，低聚合度ε-PL的含量為48.04%，之后隨著濃度的增加，透過液中低聚合度的ε-PL比例反而減少。由圖5-b可知，低聚合度ε-PL的透過率隨著濃度的增加而增大，當(dāng)初始進(jìn)料質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，低聚合度ε-PL的透過率為25.25%。進(jìn)料濃度會(huì)影響ε-PL的透過，隨著濃度增加，低聚合度ε-PL透過率得到提高，同時(shí)高聚合度ε-PL的透過率也會(huì)隨之增加，濃度增加到一定值時(shí)，膜對(duì)高低聚合度的ε-PL的選擇性降低。在本研究中，料液質(zhì)量濃度為20 g/L，透過液中低聚合度ε-PL的比例最高，綜合分離效果更好，選擇20 g/L作為后續(xù)研究中的初始料液濃度。

2.5 透析前后產(chǎn)品聚合度變化

ε-PL溶液經(jīng)VT透析后循環(huán)液和透過液色譜圖如圖6所示。循環(huán)液和透過液收集經(jīng)濃縮控制質(zhì)量濃度在10 g/L左右。經(jīng)過不斷加水循環(huán)透析，循環(huán)液中聚合度<25的ε-PL幾乎被去除，經(jīng)過歸一化處理，此時(shí)循環(huán)液中聚合度為25～35的ε-PL含量為91.22%。相對(duì)于原產(chǎn)品，25～35的ε-PL比例提高了8.38%。

2.6 不同聚合度分布的ε-PL產(chǎn)品的抑菌活力

通過VT透析后，我們比較了原產(chǎn)品與分離后產(chǎn)品的抑菌活力。由表2、表3可知，經(jīng)過透析之后，循環(huán)液中25～35聚合度的ε-PL比例增加，無論是對(duì)于大腸桿菌還是金黃色葡萄球菌，其MIC值均低于原產(chǎn)品。而對(duì)于酵母和霉菌，透析后的產(chǎn)品與原來產(chǎn)品的抑菌活性無明顯差異?？梢?，高聚合度的ε-PL更有利于抑制細(xì)菌。

表2 VT透析前后聚合度比例Table 2 The ratio of polymerization degree before and after VT dialysis

表3 不同ε-聚賴氨酸產(chǎn)品的最小抑菌濃度Table 3 The MIC of different ε-PL products

2.7 高低聚合度 ε-PL透過VT膜的模型分析

為了研究ε-PL透過膜VT的方式，我們分析了ε-PL的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表4所示。ε-PL主鏈?zhǔn)情L(zhǎng)的脂肪族烴鏈，幾乎不形成螺旋結(jié)構(gòu)，主要為ε-折疊構(gòu)象[20]。ε-PL側(cè)鏈氨基的電離常數(shù)為8.0～9.0，當(dāng)pH值低于電離常數(shù)時(shí)，氨基帶有強(qiáng)正電荷，這導(dǎo)致主鏈中的殘基相互排斥，無法形成氫鍵并自由膨脹，在pH<8～9的循環(huán)液和透過液中，ε-PL主要為β-折疊和無規(guī)卷曲構(gòu)型。

表4 不同pH水溶液中ε-PL二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 4 Structure of ε-PL in different pH aqueous solutions

由圖7可知，與循環(huán)液相比，透過液中不同聚合度的ε-PL均有透過，而低聚合度ε-PL透過較多。VT由PES制成的表面活性層與支撐層2層組成，該膜的分離作用主要取決于表面活性層，活性層內(nèi)含有相互交聯(lián)的孔道。在pH<8～9的循環(huán)液和透過液中，不同分子質(zhì)量的ε-PL呈折疊線型分子結(jié)構(gòu)。當(dāng)線型分子與膜面垂直時(shí)均能進(jìn)入膜通道并透過，分子質(zhì)量>3 000 Da的ε-PL仍然可能通過膜內(nèi)的通道，分子質(zhì)量<3 000 Da的ε-PL也可能會(huì)因?yàn)樵谀さ谋砻妗凹軜颉倍唤亓粝聛?，如圖8所示。分子質(zhì)量越大，在膜表面“架橋”的幾率越大。在透析的過程中，分子質(zhì)量<3 000 Da的ε-PL更容易透過膜，導(dǎo)致了高低聚合度ε-PL透過速度的差異，通過不停地向循環(huán)液加水循環(huán)，循環(huán)液中低聚合度ε-PL含量降低。但由于高低聚合度ε-PL分子質(zhì)量差異不大，且均能透過膜片，單純靠分子質(zhì)量的差異，并不能實(shí)現(xiàn)高低聚合度ε-PL的絕對(duì)分離。

3 結(jié)論

本研究嘗試在下游分離提取環(huán)節(jié)提高產(chǎn)品中高聚合度(25～35)ε-PL含量，篩選了截留分子質(zhì)量為3 000 Da的PES膜VT，確定了該膜片用來高低聚合度ε-PL的操作壓力、料液pH和初始料液濃度。在操作壓力0.25 MPa下，對(duì)pH=6，初始質(zhì)量濃度為20 g/L的料液進(jìn)行了透析，透析之后的產(chǎn)品中聚合度在25～35的ε-PL含量達(dá)91.22%，較原產(chǎn)品提高了8.38%；比較透析前后產(chǎn)品的抑菌性能，透析之后產(chǎn)品更有利于細(xì)菌的抑制。最后，對(duì)于膜工藝分離ε-PL的分離過程進(jìn)行了分析。膜分離工藝不能實(shí)現(xiàn)不同聚合度ε-PL的絕對(duì)分離，但可以提高產(chǎn)品中高聚合度ε-PL的比例，提高產(chǎn)品對(duì)細(xì)菌的抑菌性能，對(duì)于提高ε-PL應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。