何 建，阮彩彪，涂曉嶸，涂國全

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330045)

生物法測發(fā)酵液中紅谷霉素效價

何 建，阮彩彪，涂曉嶸，涂國全*

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330045)

目的:建立檢測紅谷霉素效價的方法。方法:采用生物量法，以金黃色葡萄球菌為指示菌，通過測定穩(wěn)定指示菌菌懸液濃度及細菌培養(yǎng)基厚度參數(shù)，得到以紅谷霉素標(biāo)準(zhǔn)液濃度的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，其抑菌圈直徑的平方為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果:得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.0031x－0.7935，R2=0.9946。結(jié)論:對生物法測抗生素效價主要影響因素量化并穩(wěn)定控制后，得到重復(fù)性好的生物法測發(fā)酵液中紅谷霉素效價的檢測方法。

紅谷霉素，生物法檢測，效價

從土壤中分類篩選到一株鏈霉菌，簡稱鏈霉菌702，其所產(chǎn)生物活性物質(zhì)對棉花枯萎病菌有較強的抑菌活性，從該菌的發(fā)酵產(chǎn)物分離提取和純化其抗細菌活性物質(zhì)，經(jīng)紅外、質(zhì)譜和核磁共振譜測定結(jié)果表明，該活性物質(zhì)與放線菌素X2(ActinomycinX2)同質(zhì)，命名為紅谷霉素(Honggumycin)［1－4］。在抗生素檢測中，生物法由于各參數(shù)不利于控制，所以重復(fù)性較差，但此法方便、直觀、花費少，所以在估測發(fā)酵液中抗生素效價時常被采用［5－7］。本文對生物法檢測發(fā)酵液中新農(nóng)抗702效價進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

抗生素 紅谷霉素(99.47%)，本實驗室提供;檢測菌種 金黃色葡萄球菌;檢測培養(yǎng)基 細菌培養(yǎng)基;發(fā)酵液 鏈霉菌702發(fā)酵液，本實驗室制備。

722可見光分光光度計 上海光譜精密儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測菌懸液的制備 將連續(xù)活化1～2次的檢測菌接種于細菌斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h。之后用適量無菌水將斜面上的菌洗脫下來，充分搖勻，作為指示菌菌懸液備用。

1.2.2 指示菌菌懸液計數(shù) 光電比濁法，平皿計數(shù)［8］。采用梯度系數(shù)法將指示菌菌懸液稀釋不同倍數(shù)，用722分光光度計在660nm處測不同稀釋度的菌懸液透光度值，同時將不同稀釋度的菌懸液稀釋涂布平板，37℃培養(yǎng)24h后計數(shù)。

1.2.3 雙層檢測平板的制備 取(10mL)滅菌細菌培養(yǎng)基加熱融化后倒入90mm的無菌平皿中，水平靜置待其凝固，作為底層;另取滅菌細菌培養(yǎng)基，待其冷卻至50～60℃時，向其加入檢測菌懸液(培養(yǎng)基與菌懸液體積比為1∶20)，振蕩搖勻后取(10mL)迅速倒入已鋪好底層的平皿中，水平靜置待其凝固，作為菌層。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 準(zhǔn)確稱取5.0266μg紅谷霉素(99.47%)粉末，加入50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，用無菌水定容至50mL，配成100μg/mL紅谷霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.5 牛津杯的放置 本實驗中所用牛津杯為不銹鋼圓筒，內(nèi)徑6mm，外徑8mm，高10mm。待制備好的雙層平板靜置15min后，用滅過菌的鑷子在平板上等距離均勻放置6個牛津杯，滴加樣品及待測溶液。

1.2.6 樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液的注入 取標(biāo)準(zhǔn)品和待測品滴加于牛津杯中(295μL/個)，一皿中不同劑量的同一標(biāo)準(zhǔn)品和待測品各滴加2個牛津杯，每個皿中滴加2個牛津杯用于校正的中心濃度標(biāo)準(zhǔn)品。加樣后將平板水平放入到37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24h。

表2 紅谷霉素標(biāo)準(zhǔn)品效價測定結(jié)果

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定與繪制 培養(yǎng)20～24h后，將平板從培養(yǎng)箱中取出，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，并通過中心濃度校正后，以抑菌圈直徑的平方為橫坐標(biāo)，紅谷霉素濃度(濃度單位為μg/mL)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測品抑菌圈直徑代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出待測樣品的效價。

2 結(jié)果與討論

2.1 管碟擴散法基本參數(shù)的確定

培養(yǎng)基厚度∶確定為在直徑90mm的培養(yǎng)皿中總加入20mL培養(yǎng)基時的厚度。培養(yǎng)基過少則培養(yǎng)基容易干裂，過多則使得培養(yǎng)皿皿蓋接觸到抗菌液。

指示菌菌懸液濃度∶比較敏感菌菌懸液不同濃度(用可見分光光度計在660nm處測其透光度值)所制得的雙層檢測平板的抑菌效果，如圖1、表1所示，指示菌濃度為106個/mL時，金黃色葡萄球菌濃度較稀松，抑菌圈邊緣模糊，不易于觀察測量;指示菌金黃色葡萄球菌濃度為108個/mL時，指示菌濃度過密，同樣濃度紅谷霉素產(chǎn)生的抑菌圈相對較小，不利于區(qū)分濃度較接近的發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌圈，容易產(chǎn)生誤差;指示菌濃度為107個/mL時，金黃色葡萄球菌生長良好，濃度適宜，抑菌圈圓整性較好，邊緣清晰，最有利于觀察和測量。因此，確定敏感菌液濃度為107個/mL。以1∶20比例加入指示菌培養(yǎng)基中所制備的雙層檢測平板，在37℃條件下培養(yǎng)20～24h。

圖1 不同指示菌濃度抑菌效果

表1 不同指示菌濃度時的抑菌效果

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定與繪制

對檢測方法中各項參數(shù)量化并穩(wěn)定控制后，紅谷霉素含量僅是抑菌圈直徑的一次函數(shù)。測定結(jié)果如表2所示，實驗結(jié)果均為三次實驗平均值。

根據(jù)效價測定結(jié)果，以抑菌圈直徑的平方為橫坐標(biāo)，紅谷霉素濃度(濃度單位為μg/mL)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

圖2 一劑量管碟法測紅谷霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖 2可知，在紅谷霉素質(zhì)量濃度為 0.5～6.5μg/mL時，抑菌圈直徑的平方與紅谷霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，其方程為y= 0.0031x－0.7935，R2=0.9946。這種檢測方法的最小檢測濃度為0.5μg/mL，最大檢測濃度為6.5μg/mL。

2.3 發(fā)酵液中紅谷霉素效價檢測

利用生物量法檢測3批搖瓶發(fā)酵液中紅谷霉素效價，分別測得紅谷霉素質(zhì)量濃度為∶1.85、1.879、1.888g/L。

2.4 討論

抗生素效價檢測方法較多，其中生物法較為直觀，操作也不復(fù)雜，且不需要高設(shè)備投資，但其受操作等因素影響。本實驗對主要影響因素指示菌培養(yǎng)基厚度、指示菌濃度進行量化。指示菌培養(yǎng)基厚度∶底層10mm、上層10mm;指示菌菌懸液濃度∶采用107個/mL(在660nm處其透光度值42%進行控制)。

3 結(jié)論

生物法測紅谷霉素效價，以金黃色葡萄球菌為指示菌，得到紅谷霉素效價單位在0.5～6.5μg/mL時其抑菌圈直徑標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線相關(guān)性好，能較準(zhǔn)確地估測出發(fā)酵液中紅谷霉素效價，且重復(fù)性好。

［1］李昆太，黎循航，涂國全，等.702生物防腐劑對細菌、霉菌和酵母菌類抑菌效果的初步測定［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，24(5):599－601.

［2］黎循航，劉姝，涂國全，等.鏈霉菌702所產(chǎn)生物活性物質(zhì)抑菌活性的初步研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，24(6): 829－832.

［3］魏賽金，鐘敏，黃林，等.鏈霉菌702所產(chǎn)抗細菌組分S2的分離純化［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，28(3):453－457.

［4］鐘敏，孫宇輝，涂國全，等.鏈霉菌702所產(chǎn)抗細菌組分S2的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2007，36(3):307－311.

［5］蔣克海.管碟法效價測定中實驗結(jié)果的影響因素及有效控制［J］.安徽醫(yī)藥，2007，11(1):17－18.

［6］舒暢，韓立，崔清蘭，等.淺談抗生素管碟測定法的操作要點［J］.河南畜牧獸醫(yī)，2007，28(5):39－40.

［7］黃鏡娟.管碟法測定抗生素效價結(jié)果的影響因素分析［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2006，22(18):2853－2854.

［8］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實驗［M］.北京:高等教育出版社，1999:95－96.

Study on determination of Honggumycin potency in fermentation by biological method

HE Jian，RUAN Cai－biao，TU Xiao－rong，TU Guo－quan*
(Biological Science and Engineering College of Jiangxi Agriculture University，Nanchang 330045，China)

Objective:To establish a method of test Honggumycin potency.Methods:Using biomass method，taking Staphylococcus aureus as the indicator bacteria，determining stability the parameter of indicator bacteria concentrations and bacterial suspension medium thickness.The standard curve by the concentration of standard Honggumycin as the vertical axis，inhibition zone diameter square as abscissa was obtained.Results:The standard curve equation:y=0.0031x－0.7935，R2=0.9946.Conclusion:After stability control and quantization of the main factors，reproducible test method of Honggumycin potency by biological fermentation was obtained.

Honggumycin;biological method test;potency

TS207.3

A

1002－0306(2011)11－0441－02

2010－09－06 *通訊聯(lián)系人

何建(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:微生物學(xué)。

江西省科技支撐計劃項目(2009BNA07200)。