莊靈習(xí)，段 然，陳龍軍，凌雪萍，盧英華，*

(1.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建廈門361005; 2.廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣東廣州510316)

朱黃青霉α-1,6-葡聚糖酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)

莊靈習(xí)1，段 然1，陳龍軍2，凌雪萍1，盧英華1，*

(1.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建廈門361005; 2.廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣東廣州510316)

α-1，6-葡聚糖酶是專一作用于α-1，6糖苷鍵產(chǎn)生小分子葡聚糖的一類水解酶，廣泛的運(yùn)用于制糖工業(yè)和啤酒工業(yè)中。采用PCR法擴(kuò)增朱黃青霉(Penicillium minioluteum)C12114的α-1，6-葡聚糖酶基因，將其插入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K。經(jīng)Sac I酶線性化電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母基因組，構(gòu)建重組酵母GS115/pPIC9K-dex。對(duì)構(gòu)建成功的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行1.5%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，在30℃條件下培養(yǎng)7d時(shí)酶活達(dá)到最大值，為88.35U/mL。

α-1，6-葡聚糖酶，朱黃青霉，畢赤酵母，誘導(dǎo)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

朱黃青霉C12114和大腸桿菌E.coli DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存;畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K和畢赤酵母菌株GS115 Invitrogen公司;膠回收試劑盒、酵母基因組提取試劑盒 深圳尚能生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶、pMD18-T載體系統(tǒng)和T4 DNA連接酶 日本TaKaRa公司;DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、Taq DNA聚合酶 大連寶生物工程公司;質(zhì)粒提取試劑盒、無氨基酸的硫酸銨酵母氮源培養(yǎng)基、抗生素G418、蛋白分子標(biāo)準(zhǔn) 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;測(cè)序及引物合成 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成;其他生化試劑 國(guó)產(chǎn)分析純;朱黃青霉斜面培養(yǎng)基PDA(g/L) 酵母膏5，葡萄糖10，瓊脂20，自然pH;朱黃青霉菌絲體液體培養(yǎng)基(g/L) 玉米漿20，蔗糖20，酵母膏5，CaCO35，pH 5.8;LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌DH5α培養(yǎng)，YPD、MD培養(yǎng)基用于重組畢赤酵母的篩選，BMG和BMM培養(yǎng)基用于重組畢赤酵母的培養(yǎng)表達(dá)，具體配方見Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊(cè)［8］;引物 使用引物序列如表1所示，其中 F1、F2為朱黃青霉C12114中α-1，6-葡聚糖酶基因的上下游引物，在上游引物F1的5’端引入EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物F2的5’端引入Not I酶切位點(diǎn)(表中劃線部分)。

表1 實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 朱黃青霉的菌體培養(yǎng)、DNA的提取及dex基因的獲得 將PDA斜面培養(yǎng)基(30℃恒溫培養(yǎng))上的朱黃青霉C12114接種至菌絲體液體培養(yǎng)基中，30℃，150r/min搖床培養(yǎng)約3～4d。離心收集菌絲，無菌水沖洗，液氮速凍，研磨后參照吳發(fā)紅等［9］使用SDS法提取朱黃青霉的總DNA。

以獲得的總DNA為模板，PCR擴(kuò)增dex基因。反應(yīng)體系含4μL 25mmol/LMgCl2、0.5μL 10mmol/L dNTP、0.5μL(2.5U)Taq DNA聚合酶、各 0.5μL 10μmol/L的上下游引物(F1和F2)和總DNA模板0.5μL，擴(kuò)增條件見表2。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收預(yù)期大小的片段，與pMD-T載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含氨芐青霉素LB平板上，挑選陽性克隆，提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 重組畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序正確定義的α-1，6-葡聚糖酶基因用EcoR I和Not I雙酶切，并與同樣經(jīng)過 EcoR I和 Not I雙酶切的載體pPIC9K連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)氨芐抗性和卡那霉素選擇篩選出陽性克隆。提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建重組載體pPIC9K-dex，如圖1所示。

圖1 重組質(zhì)粒pPIC9K-dex

1.2.3 重組畢赤酵母的轉(zhuǎn)化和篩選 將活化后的畢赤酵母 GS115菌株接種到30mL YPD培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)過夜至 OD600為1.0～1.5。取5mL 4℃離心并收集菌體，用預(yù)冷的無菌水和1mol/L山梨醇分別洗滌菌體兩次，將所得菌體懸浮于80μL預(yù)冷的1mol/L山梨醇溶液中。加入20μL經(jīng)Sac I線性化的重組表達(dá)載體充分混勻，將上述混合液移至0.2cm電擊杯中，冰浴5min，用電轉(zhuǎn)化儀電擊，條件為1500V，25μF。電擊結(jié)束后向電擊杯內(nèi)加入1mL預(yù)冷的1mol/L山梨醇溶液，分別取200、300、500μL涂布于缺少組氨酸的MD平板，30℃條件下培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。以不含載體的GS115為陰性對(duì)照。

用滅菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)種到含0.25、0.5、1.0、1.5、2g/L G418的YPD培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)2d，在高濃度G418平板上生長(zhǎng)的即為高拷貝轉(zhuǎn)化子。獲得的高拷貝轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基MM和MD平板上，確定其甲醇利用表型，在MD和MM上均能正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子為Mut+(methanol utilization plus)型，指可利用甲醇為唯一碳源的野生型菌株。將獲得的高拷貝轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種于MM-藍(lán)色葡聚糖T2000平板，出現(xiàn)透明水解圈則是表達(dá)成功的陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 重組畢赤酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá) 將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含30mL BMG培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)24h。離心收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)移至30mL BMM誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30℃、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)168h，每24h補(bǔ)加適量甲醇至體積分?jǐn)?shù)1%。每24h取樣，10000r/min離心5min，收集上清液即為粗酶液。

1.2.5 SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物 將粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE(分離膠12%，濃縮膠5%)，粗酶液加入4×上樣緩沖液，沸水浴5min后上樣10μL進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后采用銀染法顯色［10］。

1.2.6 重組畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物分析 采用DNS法［11］測(cè)定重組α-1，6-葡聚糖酶的活性。酶活定義在pH5.0，溫度37℃下，將每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.7 重組畢赤酵母搖瓶?jī)?yōu)化 以BMG培養(yǎng)基為生長(zhǎng)培養(yǎng)基，BMM為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別考察誘導(dǎo)溫度和甲醇濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響。選擇誘導(dǎo)溫度分別為25、28、30、32℃進(jìn)行優(yōu)化;分別在誘導(dǎo)過程中添加0.5%、0.75%、1.0%、1.5%、2.0%體積分?jǐn)?shù)的甲醇，測(cè)定重組α-1，6-葡聚糖酶的活性，選擇合適的甲醇添加濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 dex基因的獲得

經(jīng)菌絲體培養(yǎng)基培養(yǎng)朱黃青霉后，采用液氮-SDS法提取總DNA，結(jié)果如圖2所示。圖2中泳道1和2分別為未添加及添加液氮研磨的結(jié)果。在研磨過程中由于液氮對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，可以看出泳道2的條帶比較亮，DNA提取效果較好。

圖2 朱黃青霉C12114的總DNA

提取的總DNA經(jīng)溫度梯度PCR擴(kuò)增得到目的基因約為1800bp，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)測(cè)序后，與朱黃青霉α-1，6-葡聚糖酶基因具有100%同源性，至此成功獲得dex基因。將dex基因連入T載體，挑取含氨芐青霉素平板上的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，成功得到載體pMD18-T-dex(圖略)。

圖3 α-1，6-葡聚糖酶基因擴(kuò)增結(jié)果注:1-DNA ladder;2～9-不同退火溫度40、42、44、46、48、50、52、54℃擴(kuò)增片段。

2.2 重組載體pPIC9K-dex的構(gòu)建

將重組體pMD18-T-dex和載體pPIC9K分別經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切，回收相應(yīng)片段、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增并抽提質(zhì)粒。將抽提的質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切，得到了1800bp左右和9000bp左右的條帶(見圖4)，證實(shí)dex基因成功插入載體pPIC9K，將重組質(zhì)粒命名為pPIC9K -dex。

圖4 雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒pPIC9K-dex注:M-DNA ladder;1-經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切片段。

2.3 重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-dex的構(gòu)建與篩選

重組質(zhì)粒用Sac I酶切線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，涂布于MD平板上篩選目的基因整合到宿主菌染色體上的轉(zhuǎn)化子?？紤]到基因拷貝數(shù)的增加一般可以提高基因產(chǎn)物的表達(dá)量，首先利用載體上的G418抗性基因篩選高基因拷貝的轉(zhuǎn)化子。將MD平板上獲得的轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種于含0.25、0.5、1、1.5和2g/L G418的 YPD平板上，30℃培養(yǎng) 3d后，篩選出抗1.5mg/mL G418的 5株菌，一般每抗 0.25mg/mL G418即為一個(gè)拷貝數(shù)，因此最終得到約6個(gè)拷貝數(shù)的重組畢赤酵母。從MD平板點(diǎn)種到MM上的轉(zhuǎn)化子都能生長(zhǎng)且菌落比MD平板上的小，故判斷其甲醇利用表型為Mut+。

將篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子點(diǎn)板于MM-藍(lán)色葡聚糖T2000平板，結(jié)果見圖5。在菌落周圍可以明顯見到透明水解圈，證明dex基因不僅已經(jīng)整合進(jìn)酵母基因組中，而且成功實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中的活性表達(dá)。

圖5 MM-藍(lán)色葡聚糖T2000平板

2.4 SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物

挑取表達(dá)菌株接種于30mL BMG的培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)約24h，離心收集菌體，用含1%甲醇的BMM培養(yǎng)基重懸菌體，誘導(dǎo)表達(dá)。不同時(shí)間取樣，發(fā)酵液上清溶于5×上樣緩沖液，SDS-PAGE檢驗(yàn)結(jié)果見圖6。從圖6中可見，在66ku附近有一相應(yīng)條帶，其與天然的朱黃青霉α-1，6-葡聚糖酶理論分子量相符(67ku)，而陰性對(duì)照中沒有相應(yīng)條帶。畢赤酵母對(duì)重組蛋白的糖基化作用可能是目的蛋白分子量稍大的原因。

2.5 溫度和甲醇濃度對(duì)重組畢赤酵母表達(dá)的影響

以1%甲醇為碳源誘導(dǎo)重組畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，α-1，6-葡聚糖酶活性隨時(shí)間變化曲線如圖7所示。圖7中顯示培養(yǎng)基中的α-1，6-葡聚糖酶活性在誘導(dǎo)120h時(shí)可達(dá)到42.51U/mL。

圖6 重組酵母的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果注:1-P.pastoris GS115的上清;2～4-經(jīng)甲醇誘導(dǎo)24、72、120h的P.pastoris GS115/pPIC9K-dex上清。

圖7 重組畢赤酵母在BMM培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶曲線

溫度是影響微生物生長(zhǎng)和表達(dá)的最為關(guān)鍵的因素之一。溫度升高，有利于微生物的生長(zhǎng)代謝和蛋白表達(dá)，但溫度過高也會(huì)使菌體過早衰老，發(fā)酵周期縮短，降低蛋白表達(dá)量和活性。因此，必須選擇合適的溫度，而且在不同階段，應(yīng)選擇不同的溫度。圖8為誘導(dǎo)溫度對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響。28℃與30℃對(duì)產(chǎn)酶的影響不大，當(dāng)溫度為32℃時(shí)，目的蛋白的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他三個(gè)溫度，與文獻(xiàn)報(bào)道的畢赤酵母在超過32℃的情況下生長(zhǎng)緩慢，衰退提前，已造成菌體過早死亡，表達(dá)低下［12］等相符。由于實(shí)驗(yàn)室搖床溫度限制，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)溫度選擇30℃。

圖8 誘導(dǎo)溫度對(duì)表達(dá)外源α-1，6-葡聚糖酶的影響

培養(yǎng)基的組成特別是碳源直接影響菌體生長(zhǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，故選擇合適的碳源及濃度也對(duì)重組畢赤酵母表達(dá)十分重要。甲醇作為外源蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑，也是誘導(dǎo)過程中的碳源。在甲醇連續(xù)添加的情況下，可能造成甲醇蓄積，對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用，添加量不足，又會(huì)造成碳源不足，影響菌體生長(zhǎng)。通過優(yōu)化甲醇添加濃度發(fā)現(xiàn)1.5%體積分?jǐn)?shù)的甲醇添加量對(duì)α-1，6-葡聚糖酶的表達(dá)最為合適，在144h時(shí)酶活達(dá)到88.35U/mL，見圖9。

3 結(jié)論

圖9 甲醇濃度對(duì)表達(dá)外源α-1，6-葡聚糖酶的影響

α-1，6-葡聚糖酶在醫(yī)療、牙科及制糖工業(yè)中具有十分重要的應(yīng)用［13］，但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于α-1，6-葡聚糖酶的研究相對(duì)于其他類型的葡聚糖酶類如β-1，3-葡聚糖酶等并不深入。本研究通過PCR技術(shù)從朱黃青霉C12114菌株中成功擴(kuò)增出α-1，6-葡聚糖酶基因，通過基因重組在畢赤酵母中成功表達(dá)α-1，6-葡聚糖酶基因。此外，對(duì)利用畢赤酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMM對(duì)α-1，6-葡聚糖酶的表達(dá)的溫度和甲醇誘導(dǎo)濃度進(jìn)行簡(jiǎn)單的優(yōu)化，結(jié)果表明:30℃，1.5%體積分?jǐn)?shù)的甲醇添加量為α-1，6-葡聚糖酶最適表達(dá)條件，最高酶活可達(dá)到88.35U/mL。畢赤酵母作為高效表達(dá)外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，可高密度發(fā)酵是其重要的優(yōu)點(diǎn)，今后將結(jié)合搖瓶培養(yǎng)的優(yōu)化結(jié)果指導(dǎo)重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-dex的發(fā)酵罐培養(yǎng)，使α-1，6-葡聚糖酶能夠高效表達(dá)。

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Expression of α-1，6-dextranase from Penicillium minioluteum in P.pastoris

ZHUANG Ling-xi1，DUAN Ran1，CHEN Long-jun2，LING Xue-ping1，LU Ying-hua1，*
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Xiamen University，Xiamen 361005，China; 2.Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute，Guangzhou 510316，China)

α-1，6-dextranase，which can hydrolyze dextran specifically by cutting off the α-1，6-glycosidic bond to release shorter saccharides，was widely used in many fields such as sugar industry and beer industry.The gene of α-1，6-dextranase(dex)was amplified through PCR by using Penicillium minioluteum C12114 genomic DNA as template.The amplified gene was cloned into vector pPIC9K and the recombinant plasmid pPIC9K-dex was linearzed with Sac I，then transformed into P.pastoris GS115 by electroporation.The positive transformant was induced to express the enzyme with 1.5%methanol for 7 days under the 30℃，and the activity of the enzyme could reach 88.35U/mL.

α-1，6-dextranase;Penicillium minioluteum;P.pastoris;induction

TS201.3

A

1002-0306(2011)11-0194-04

α-1，6-葡聚糖(Dextran)是α-D-吡喃型葡萄糖的聚合物，主要通過α-1，6糖苷鍵連接，含有少量的α-1，2、α-1，3和α-1，4糖苷鍵。葡聚糖在醫(yī)療上可以代替血漿，控制藥物釋放;在牙科中，葡聚糖會(huì)與唾液中的糖蛋白形成牙菌斑;而在制糖工業(yè)中，腸系膜狀白念珠菌(Leuoconostoc mesenteroides)利用蔗糖合成葡聚糖，造成糖分損失，使糖汁粘度增高導(dǎo)致過濾困難，蔗糖的結(jié)晶效率降低，糖的精煉質(zhì)量下降等［1-2］。α-1，6-葡聚糖酶能夠切斷葡聚糖中的α-1，6-糖苷鍵，產(chǎn)生異麥芽糖或異麥芽三糖以及分子量較小的葡聚糖，使其失去親水性和粘性，提高精糖的質(zhì)量和制糖效率。真菌中的青霉菌、油脂酵母、黑曲霉以及細(xì)菌中的鏈球菌、芽孢桿菌都能產(chǎn)生α-1，6-葡聚糖酶［3］。真菌中的朱黃青霉(Penicillium minioluteum)產(chǎn)生的α-1，6-葡聚糖酶具有較高的熱穩(wěn)定性，適合運(yùn)用于制糖工業(yè)中［4］。朱黃青霉來源的α-1，6-葡聚糖酶屬于糖苷水解酶類的GH49類，分子大小為67ku，等電點(diǎn)為3.88，其最適反應(yīng)pH為5.0［5］。由于青霉菌的生長(zhǎng)較慢，產(chǎn)物的活性和產(chǎn)量較低，提取純化不易，難以適合工業(yè)化生產(chǎn)。畢赤酵母(P.pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種優(yōu)秀的真核表達(dá)系統(tǒng)，不僅能夠大量表達(dá)異源蛋白，而且也能對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾如適度糖基化、正確折疊、形成二硫鍵等，從而保持異源蛋白的生物活性［6-7］。本實(shí)驗(yàn)將朱黃青霉C12114的α-1，6-葡聚糖酶基因?qū)氘叧嘟湍副磉_(dá)載體pPIC9K中構(gòu)建重組菌，研究α-1，6-葡聚糖酶在畢赤酵母中的表達(dá)，以提高 α-1，6-葡聚糖酶的產(chǎn)量用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2010-11-17 *通訊聯(lián)系人

莊靈習(xí)(1986-)，女，碩士，在讀研究生，研究方向:微生物發(fā)酵。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目。