吳 玲，張 敏

(1.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程技術(shù)系，江蘇常州213164; 2.江蘇省常州市出入境檢驗檢疫局，江蘇常州213003)

發(fā)酵產(chǎn)品中乳酸菌抑菌效果研究

吳 玲1，張 敏2

(1.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程技術(shù)系，江蘇常州213164; 2.江蘇省常州市出入境檢驗檢疫局，江蘇常州213003)

從發(fā)酵產(chǎn)品中分離出的20株乳酸菌中篩選得到1株乳酸菌菌株GL5，該乳酸菌對金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌等致病菌具有較強的抑制性，通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征的觀察，生理生化特征的鑒定，并參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，該菌株與干酪乳桿菌最相似。

乳酸菌，抑菌，鑒定

乳酸菌是一類能以糖為原料，發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。乳酸菌是正常人畜腸道中極為重要的生理菌群，擔(dān)負(fù)著人畜機體多種重要的生理功能，具有維持人體中微生態(tài)平衡的作用。而且，乳酸菌能夠產(chǎn)生有機酸(如乳酸、丁酸和醋酸等)、過氧化氫和細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)［1］。這些少量的抑菌物質(zhì)如果被添加至食品中，不僅不破壞食品的風(fēng)味和組織狀態(tài)，還可以抑制腐敗菌和病原菌的生長，從而防止腐敗，延長食品的保藏期。其中起主要抑菌作用的是細(xì)菌素，其具有一定的熱穩(wěn)定性，易被人體消化道的部分蛋白酶降解，并且不會在體內(nèi)蓄積引起不良反應(yīng)，被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的天然食品防腐劑和飼料添加劑［2］。因此，篩選高抑菌活性的乳酸菌，并將其投入生產(chǎn)，有著廣闊的市場前景。本實驗欲從各種發(fā)酵產(chǎn)品(如酸奶、奶酪、泡菜等)中分離乳酸菌，研究各種乳酸菌對食品中常見致病菌的抑制作用，最終篩選出抑菌效果較好的乳酸菌菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

各品牌腌漬菜、進(jìn)口奶酪和酸奶 市售;乳酸菌分離培養(yǎng) BCG培養(yǎng)基，A、B液滅菌后混勻(A液:脫脂奶粉50g，1.6%溴甲酚綠酒精液0.35mL，蒸餾水250mL，90℃，開蓋滅菌10min;B液:酵母膏5g，瓊脂10g，蒸餾水250mL，pH 6.8，121℃滅菌20min;A、B液滅菌后在無菌狀態(tài)下混勻后倒平板［3］);MRS液體培養(yǎng)基 蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸三銨1.45g、K2HPO4·H2O 2.6g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、吐溫80 1.0g、蒸餾水1000mL，pH 6.2～6.4，121℃，滅菌20min;單增李斯特菌(Listeria monocytogens)、阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、大腸桿菌(Escherichia coli) 均購于廣東微生物菌種保藏中心;脫脂奶粉 光明乳業(yè)股份有限公司;各類糖發(fā)酵管、SS培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;酵母膏、蛋白胨、牛肉膏 均為生化試劑;葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸三銨等 均為分析純試劑。

SHP-150恒溫培養(yǎng)箱 上海山連實驗設(shè)備有限公司;GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所有限公司;FD-1D-5型真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 泡菜樣品處理:以無菌操作取各種泡菜汁液1mL，并用無菌生理鹽水依次稀釋為10-3、10-4、10-5。奶酪、酸奶樣品處理:以無菌操作取奶酪(或酸奶)1g，放入含有9mL滅菌加熱至含40℃左右生理鹽水的滅菌廣口瓶內(nèi)，待奶酪溶解制成1∶10的均勻稀釋液，并用無菌生理鹽水逐級稀釋至10-3、10-4、10-5。

1.2.2 乳酸菌的分離純化 采用BCG牛乳培養(yǎng)基對稀釋樣品中的微生物通過平板傾注法進(jìn)行分離純化，37℃培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。挑取少量進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，篩選出符合乳酸菌形態(tài)特征的菌株［4］，并將其保存于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，編號，待用。

1.2.3 乳酸菌的抑菌實驗-管碟法 將初篩的乳酸菌菌株轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中活化，37℃培養(yǎng)48h，將發(fā)酵液在4℃下，以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液并測定其pH，將上清液用1.0mol/L NaOH調(diào)至pH6.5后［5］，利用管碟法測定不同乳酸菌發(fā)酵液對各指示菌的抑制作用。

1.2.4 乳酸菌的鑒定 乳酸菌的鑒定具體參見《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第八版)》與《乳酸細(xì)菌分類鑒定與實驗方法》。

1.2.5 乳酸菌的保藏 將具有較強抑菌活性的乳酸菌活化培養(yǎng)，并加入一定的保護(hù)劑［6］，在-76℃及真空下凍干3d后，置-20℃冰箱貯藏。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌實驗結(jié)果

通過BCG培養(yǎng)基，從各品牌腌漬菜、進(jìn)口奶酪和酸奶中共篩選出20株疑似乳酸菌。經(jīng)管碟法抑菌實驗驗證，從泡菜汁中分離出的2株乳酸菌(分別命名為PC3和PC15)和從進(jìn)口奶酪中分離出的1株乳酸菌(命名為GL5)對指示菌金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌都有很好的抑制作用，結(jié)果見表1。其中，GL5抑菌效果最佳，如圖1所示。各種乳酸菌對革蘭氏陽性菌的抑菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌。

圖1 GL5菌株抑金黃色葡萄球菌實驗結(jié)果

表1 三種乳酸菌對各指示菌的抑菌圈直徑(mm)

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征觀察 GL5菌株經(jīng)革蘭氏染色為G+，顯微鏡觀察為桿狀，長短不一，多成鏈出現(xiàn)，無鞭毛，無芽孢。菌落光滑，凸起，大部分為白色，有個別黃色。

2.2.2 生理生化特征鑒定 生理生化特征鑒定主要實驗項目包括GL5在不同溫度(15、35、45℃)實驗菌種的生長情況，在不同pH(4.5、5.4、9.0)培養(yǎng)基中的生長情況，過氧化氫酶實驗，明膠液化實驗，吲哚實驗，硫化氫產(chǎn)生實驗，精氨酸產(chǎn)氨實驗與各種糖發(fā)酵實驗。

表2 GL5菌株生理生化實驗結(jié)果

根據(jù)菌種的形態(tài)特征與生理生化特性，參考資料［4，7］，將GL5初步鑒定為乳桿菌屬。接著對GL5菌株進(jìn)行糖發(fā)酵實驗，實驗結(jié)果如表3所示。

表3 GL5菌株糖發(fā)酵實驗結(jié)果

根據(jù)生理生化實驗結(jié)果，參考資料［4，7］，經(jīng)過刪選比對，菌株GL5的生理生化特性與干酪乳桿菌最相似。

3 結(jié)論

從發(fā)酵產(chǎn)品中分離純化了20種乳酸菌，通過管碟法抑菌實驗篩選出一種來源于進(jìn)口奶酪的抑致病菌活性較高的乳酸菌GL5，通過形態(tài)學(xué)觀察與生理生化實驗，菌株GL5初步鑒定為干酪乳桿菌。

［1］楊潔彬，葛興華.乳酸菌——生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1996.

［2］朱小喬，劉通訊.極具潛力的天然防腐劑——Nisin［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27(4):66-69.

［3］王友湘，陳慶森，閻亞麗.用于乳酸菌分離鑒定的幾種培養(yǎng)基的篩選及應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2007，28(9):374-378.

［4］凌代文.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1999:6-16.

［5］賀銀鳳，靳燁，田建軍，等.兩株產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.食品科學(xué)，2009，30(19):232-235.

［6］吳玲，潘道東，劉海燕.瑞士乳桿菌凍干保護(hù)劑的選擇［J］.食品與機械，2010，26(1):157-159.

［7］布坎南RE，吉布斯NE.伯杰細(xì)菌鑒定手冊［M］.第八版.北京:科學(xué)出版社，1984:797-808.

Study on bacteriostatic effect of lactic acid bacteria in the fermented products

WU Ling1，ZHANG Min2

(1.Department of Pharmaceutics＆Biology Engineering and Technology，Changzhou Institute of Engineering Technology，Changzhou 213164，China;2.Changzhou Entry-Exit Inspection and Quanrantine Bureau，Changzhou 213003，China)

20 kinds of lactic acid bacteria were isolated from fermented products，and GL5 from cheese had the highest bacteriostatic activity against pathogenic bacteria such as Staphyloccocus aureus，Enterobacter sakazakii，and Salmonella typhimurium，et al.GL5 was homologous with Lactobacillus casei based on the morphological，physiological characteristics and Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.

lactic acid bacteria;bactriostasis;indentification

TS201.3

A

1002-0306(2011)11-0181-02

2011-07-18

吳玲(1981-)，女，碩士研究生，講師，研究方向:食品微生物。