陳麗君，肖冬光，郭學(xué)武，張翠英，蓋偉東

(工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

面包酵母海藻糖含量與酵母耐性之間的關(guān)系

陳麗君，肖冬光*，郭學(xué)武，張翠英，蓋偉東

(工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

以存活率為指標(biāo)，探討了不同時期不同面包酵母的耐鹽性能、耐酒精性能、耐高溫性能以及耐冷凍性能，并且測定了不同時期菌體胞內(nèi)海藻糖含量，研究結(jié)果表明胞內(nèi)海藻糖含量與酵母的耐受性之間存在一定的相關(guān)性，海藻糖含量越高，酵母的耐性越好。

面包酵母，海藻糖，耐性，耐凍性，存活率

面包酵母在微生物分類學(xué)上屬于酵母屬、釀酒酵母種(Saccharomyces cerevisiae)，是面包生產(chǎn)過程中最重要的微生物發(fā)酵劑和生物疏松劑，在面包生產(chǎn)中起著關(guān)鍵作用［1］。酵母耐性一般是指耐酒精性、耐高溫性、耐鹽性以及耐冷凍性，它已成為工業(yè)生產(chǎn)、育種等方面的一個重要指標(biāo)。海藻糖是生物體內(nèi)的一種典型的應(yīng)激代謝物，被人稱為“生命之糖”，研究表明酵母耐性與菌體胞內(nèi)海藻糖含量存在著一定的關(guān)系［2－6］。許多生物在脅迫環(huán)境(如高溫、冷凍、高滲等)下表現(xiàn)出的抗逆耐受力與體內(nèi)的海藻糖含量有直接的關(guān)系，生物體可以通過促進(jìn)海藻糖的合成來抵御外界的不良傷害，所以胞內(nèi)海藻糖含量被認(rèn)為是酵母耐性的重要鑒定指標(biāo)［7－9］。但是胞內(nèi)海藻糖含量與酵母耐性之間存在一種怎樣的關(guān)系還并沒有統(tǒng)一的定論，因此酵母耐性與海藻糖含量之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。本工作首先確定了酵母存活率的測定方法，在此基礎(chǔ)上測定了不同時期、不同面包酵母菌株的耐性和菌體胞內(nèi)海藻糖含量，探討了酵母耐性與胞內(nèi)海藻糖含量之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

面包酵母菌株 實驗室保存，標(biāo)號分別為BY－6、BY－12、BY－14、A6、B6、BY－24;YEPD 培養(yǎng)基 葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，pH5.0，121℃滅菌15m in;耐鹽培養(yǎng)基 葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，NaCl 5%，121℃滅菌15m in;耐酒精培養(yǎng)基 葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，121℃滅菌15m in，待冷卻至室溫，加入15%Vol的無水乙醇。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮮酵母的制備 在30℃下，經(jīng)種子培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)24h后，以10%接種量轉(zhuǎn)入YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期，菌體經(jīng)離心洗滌2次后收集備用。

1.2.2 細(xì)胞存活率方法的確定 取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液5m L，用無菌水離心洗滌3次后，將菌體轉(zhuǎn)接于含有15%Vol酒精的YEPD培養(yǎng)基中，30℃、160r/min處理1h，以存活率為指標(biāo)，采用亞甲基藍(lán)染色法以及活菌計數(shù)法對菌株對數(shù)期的耐酒精性能進(jìn)行測定。

1.2.3 酵母耐性實驗 耐鹽性實驗:取培養(yǎng)到對數(shù)期(穩(wěn)定期)的菌液5m L，用無菌水離心洗滌3次后，轉(zhuǎn)接于含有 5%NaCl的 YEPD培養(yǎng)基中，30℃、160 r/m in處理1h，測定處理前后活菌數(shù)，計算菌體存活率。

表1 亞甲基藍(lán)染色法測定酵母存活率

表2 活菌計數(shù)法測定酵母存活率

表3 酵母耐受性與菌體胞內(nèi)海藻糖含量的關(guān)系

耐酒精實驗:取培養(yǎng)到對數(shù)期(穩(wěn)定期)的菌液5m L，用無菌水離心洗滌3次后，轉(zhuǎn)接于含有15%Vol酒精的YEPD培養(yǎng)基中，30℃、160 r/m in處理1h，測定處理前后活菌數(shù)，計算菌體存活率。

耐高溫實驗:取培養(yǎng)到對數(shù)中期(穩(wěn)定期)的菌液1m L，用無菌水離心洗滌3次后，懸浮于9m L生理鹽水中，在52℃水浴鍋中處理30m in，迅速冷卻至室溫，測定處理前后活菌數(shù)，計算菌體存活率。

耐冷凍實驗:取培養(yǎng)到對數(shù)中期(穩(wěn)定期)的菌液1m L，用無菌水離心洗滌3次后，收集菌體，放入－20℃冰箱中冷凍保存21d后，30℃解凍30min，測定冷凍前后的活菌數(shù)，計算冷凍存活率。

1.2.4 酵母胞內(nèi)海藻糖含量的測定 硫酸蒽酮法，參考文獻(xiàn)［10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母存活率測定方法的確定

選用BY－6為測試菌株，取7個平行樣，以存活率為指標(biāo)，采用染色法以及活菌計數(shù)法分別對對數(shù)期菌體的耐酒精性能進(jìn)行測定，結(jié)果見表1與表2。

由表1和表2可以看出，由染色法測定的酵母存活率上下偏差起伏較大，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.18，而活菌計數(shù)法測定的存活率數(shù)據(jù)較為一致，計算的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.61。由此可見，采用染色法測定的酵母細(xì)胞存活率比采用活菌計數(shù)法所測定的存活率誤差大很多，可能的原因是因為染色劑與放置溫度有一定的關(guān)系，另外有些細(xì)胞呈現(xiàn)淺藍(lán)色，不能準(zhǔn)確判定細(xì)胞是否死亡，所以在計數(shù)時存在很大的誤差，因此在本實驗中存活率的測定方法選用活菌計數(shù)法。

2.2 酵母耐性與海藻糖含量的關(guān)系

以存活率為指標(biāo)，測定6株面包酵母菌株對數(shù)期和穩(wěn)定期的耐受性，同時測定了6株菌株兩個時期的胞內(nèi)海藻糖含量，測定結(jié)果見表3。

由表3可知，6株不同的面包酵母菌株胞內(nèi)海藻糖含量在穩(wěn)定期普遍高于對數(shù)生長期。在對數(shù)期時，6株菌株胞內(nèi)海藻糖含量都比較低，其中BY－24胞內(nèi)海藻糖含量最高，但也只達(dá)到3.12%，A6胞內(nèi)海藻糖含量最低，只有0.98%;進(jìn)入穩(wěn)定期后，6株菌株胞內(nèi)海藻糖含量大大提高，含量基本都在10%以上，其中仍是 BY－24胞內(nèi)海藻糖含量最高，高達(dá)17.62%，比對數(shù)期提高了5.6倍，BY－6菌株海藻糖含量最低，為9.44%，但也比對數(shù)期胞內(nèi)海藻糖含量提高了9.5倍。由此可見，穩(wěn)定時期菌體胞內(nèi)可以大量積累海藻糖，這是因為海藻糖屬于生物體內(nèi)一種典型的應(yīng)激代謝物，當(dāng)細(xì)胞處于穩(wěn)定期時，胞內(nèi)開始產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，因而此時酵母細(xì)胞內(nèi)開始有大量海藻糖的積累。

從表3還可以看出，不同時期、不同面包酵母的耐性存活率也有很大差異，其中處于穩(wěn)定期的酵母菌體耐性存活率比對數(shù)期菌體耐性存活率高很多。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是因為處于對數(shù)期的菌體生長旺盛，細(xì)胞生長易受外界環(huán)境條件的影響，細(xì)胞死亡呈現(xiàn)很大的隨機(jī)性，因而測得的細(xì)胞存活率很低，并且極不穩(wěn)定。

2.3 酵母耐性與胞內(nèi)海藻糖含量相關(guān)性分析

在測定的6株面包酵母中，處于同一時期不同的面包酵母，BY－24胞內(nèi)海藻糖含量最高，其各種耐性存活率最高;穩(wěn)定期6株菌體各種耐性存活率趨勢為BY－24＞A6＞B6＞BY－14＞BY－12＞BY－6，菌體胞內(nèi)海藻糖含量趨勢為BY－24＞A6＞B6＞BY－14＞BY－12＞BY－6，二者之間的關(guān)系見圖1～圖4。由圖1～圖4可以看出，菌體的耐性存活率與胞內(nèi)海藻糖含量二者之間存在一定的相關(guān)性(R2＞0.85)，菌體胞內(nèi)海藻糖含量越高，其耐性存活率也越高，由此可以說明，海藻糖含量的積累有助于菌體耐性存活率的提高。

圖1 菌體耐酒精性能與胞內(nèi)海藻糖含量之間的關(guān)系

圖2 菌體耐鹽性能與胞內(nèi)海藻糖含量之間的關(guān)系

圖3 菌體耐高溫性能與胞內(nèi)海藻糖含量之間的關(guān)系

圖4 菌體耐冷凍性能與胞內(nèi)海藻糖含量之間的關(guān)系

3 討論

通過對6株面包酵母菌株不同時期的耐性存活率進(jìn)行測定，結(jié)果表明不同的酵母菌株處于穩(wěn)定期的各種耐性存活率普遍高于對數(shù)期的菌體存活率，因而說明穩(wěn)定期酵母菌體耐性要比對數(shù)期菌體耐性好，在穩(wěn)定期可以獲得大量菌體，有相關(guān)研究也說明了這一點［12－13］。

國內(nèi)外研究表明，菌體胞內(nèi)海藻糖含量與菌體耐受性之間存在一定的相關(guān)性［2－6］。Sukesh［2］對酵母細(xì)胞在加鹽培養(yǎng)基中的生長情況進(jìn)行了報道，發(fā)現(xiàn)海藻糖含量與細(xì)胞對外界不利環(huán)境的耐受性有著密切關(guān)系。史戈峰［3］和高峻［4］等發(fā)現(xiàn)酵母胞內(nèi)海藻糖的累積與良好的酒精發(fā)酵性能、較高的細(xì)胞存活率相關(guān)聯(lián)，證明了海藻糖積累較多時對酵母細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。Diniz－Mendes等［5］研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞經(jīng)預(yù)先短時溫和熱處理，可增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖的積累，可以提高酵母細(xì)胞的存活率。Hino等［6］研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)海藻糖的累積與較高的冷凍存活率有著密切的關(guān)系。本文對6株面包酵母菌株穩(wěn)定期的海藻糖含量測定的結(jié)果為BY－24＞A6＞B6＞BY－14＞BY－12＞BY－6，各種耐性存活率均為BY－24＞A6＞B6＞BY－14＞BY－12＞BY－6，由此可以看出胞內(nèi)海藻糖含量的提高可以大大提高菌體的耐受能力，可能是因為處于穩(wěn)定時期的菌體胞內(nèi)會大量積累海藻糖，它賦予生物體抵抗干燥、干旱、寒冷、高溫以及氧自由基等惡劣環(huán)境的能力。

到目前為止，國內(nèi)外針對于酵母幾種耐性與海藻糖含量的關(guān)系還沒有綜合性的研究，本文對酵母的耐凍性能、耐鹽性能、耐酒精性能以及耐高溫性能與菌體胞內(nèi)海藻糖含量之間的關(guān)系進(jìn)行了簡單的探討，有關(guān)酵母耐性與胞內(nèi)海藻糖含量的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。這一問題的解決將會為耐性面包酵母菌的選育開辟一條新的途徑，不僅可以提高我國焙烤食品行業(yè)的技術(shù)水平，同時對酵母行業(yè)的發(fā)展也有重要意義。

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Correlation between the trehalose content and the stress resistance of the baker yeasts

CHEN Li－jun，XIAO Dong－guang*，GUO Xue－wu，ZHANG Cui－ying，GAI Wei－dong

(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

The freeze－tolerance，the stress resistance and the trehalose content of different baker yeasts in the different periods was discussed.It was found that there was a correlation between the trehalose content and the stress resistance，and there was a better stress resistance with the higher trehalose content.

baker yeast;trehalose;stress resistance;freeze－tolerance;survival rate

TS201.2

A

1002－0306(2011)08－0112－04

2010－07－19 *通訊聯(lián)系人

陳麗君(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:現(xiàn)代釀造技術(shù)。

國家科技支撐計劃項目(2007BAK36B04);天津市科委自然基金重點項目(10JCZDJC16700)。