李思斯，江 波，張 濤，沐萬孟，繆 銘(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

銀杏外種皮總黃酮的提取及其抗氧化活性研究

李思斯，江 波*，張 濤，沐萬孟，繆 銘
(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

以乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度、浸提時間、固液比為考察因素，對銀杏外種皮黃酮的提取工藝進(jìn)行單因素及正交實驗優(yōu)化，以比色法測定其含量，確定最佳提取條件，并對銀杏外種皮總黃酮的抗氧化性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，銀杏外種皮總黃酮的較優(yōu)提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，溫度70℃、液固比25∶1，浸提時間2h，此時提取率為91.01%。銀杏外種皮總黃酮具有良好的體外抗氧化能力。當(dāng)黃酮濃度為0.75mg/mL時，和0.10mg/mL的抗壞血酸的還原能力相當(dāng)。銀杏外種皮總黃酮清除DPPH·、O－2·和·OH的半數(shù)抑制濃度各為0.1654、0.8519、0.3843mg/mL。

銀杏外種皮，總黃酮，提取，抗氧化，自由基

黃酮是銀杏葉及其外種皮中最重要的有效成分之一。由銀杏葉開發(fā)而成的銀杏提取物及其制劑是目前深受人們歡迎的天然藥物之一，但是據(jù)統(tǒng)計，我國每年約有3萬 t左右外種皮作為廢物被丟棄［1］。由于被廢棄的外種皮長期得不到合理的處置和利用，其中的酚酸類等物質(zhì)在很多地區(qū)已對環(huán)境造成嚴(yán)重污染［2－3］。黃酮類化合物具有降壓、降血脂、增加冠脈流量、強(qiáng)心、抗心律不齊等藥理作用［4］，隨著人們不斷發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)所具有的生理功能，對其的研究與應(yīng)用日益增多。因此，從銀杏外種皮中提取黃酮類物質(zhì)，具有廣闊的研究與開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏外種皮 購于江蘇省泰興市;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品

上海同田生物有限公司，色譜純;1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH) Sigma公司;甲醇、乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸鈉、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、氯化高鐵、三氯乙酸 均為國產(chǎn)分析純。

DFY－500型中藥粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;調(diào)溫電熱器 上海聯(lián)營通州市申通電熱器廠;HWS12型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DZG－6050型真空干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;HS7磁力攪拌器 德國IKA公司;Eppendorf AG 5804R離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 銀杏外種皮→清洗→曬干→粉碎(過60目篩)→乙醇溶劑浸提→離心(9000r/min)→合并上清液減壓濃縮→真空干燥

1.2.2 黃酮的測定 準(zhǔn)確吸取樣品溶液1m L置于10m L具塞試管中，蒸餾水為空白對照，加體積分?jǐn)?shù)30%乙醇定容至5m L。加入質(zhì)量濃度50g/L的亞硝酸鈉溶液0.3m L，搖勻，放置6min。加入質(zhì)量濃度100g/L硝酸鋁溶液0.3m L，迅速搖勻，放置6m in。加入4m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)40g/L氫氧化鈉溶液并用蒸餾水定容至10m L，搖勻。室溫顯色15min后于510nm波長處測吸光值。

表1 各反應(yīng)體系溶液組成(mL)

1.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確配制0.126mg/m L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L 標(biāo)準(zhǔn)液置于10m L具塞試管中，蒸餾水為對照，按照1.2.2中的測定方法進(jìn)行測定。以吸光度為橫坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1得出線性回歸方程為y=0.1062x+0.0004，R2=0.9943。

1.2.4 銀杏外種皮總黃酮總含量的測定 準(zhǔn)確稱取1.000g銀杏外種皮粉末，加入75m L乙醇，90℃下于索氏抽提器中抽提至抽提液無色后，再換50m L乙醇進(jìn)行抽提，直到將抽提液滴加到預(yù)先滴有10%三氯化鋁與氫氧化鈉混合液的顯色板上時不再顯色，則抽提終止［5］。合并兩次抽提液，減壓濃縮后定容至50m L。按照1.2.2中的方法測定其吸光值，并根據(jù)1.2.3的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出黃酮總含量為0.2430mg/m L。

1.2.5 總黃酮提取的單因素及正交實驗 采用乙醇回流的方法，選取溫度、液固比、浸提時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)作為影響因素進(jìn)行單因素實驗。根據(jù)單因素實驗結(jié)果設(shè)計正交實驗。按照1.2.2中的方法測定提取液的吸光值，并根據(jù)1.2.3的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量。

以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，確定銀杏外種皮總黃酮的最佳提取工藝條件。

1.2.6 銀杏外種皮總黃酮的抗氧化活性研究

1.2.6.1 銀杏外種皮總黃酮還原能力的測定［6］取1m L樣品，加入2.5m L 0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.6)，2.5m L 1%(w/v)的鐵氰化鉀溶液;于50℃保溫20m in，加入2.5m L 10%(w/v)三氯乙酸溶液，混勻后650 r/m in離心10min，取上清液2.5m L加2.5m L去離子水，0.5m L 0.1%(w/v)氯化高鐵溶液，混勻。于700nm處測吸光值。

1.2.6.2 銀杏外種皮總黃酮對DPPH·清除能力的測定［7］取1m L樣品置于試管中，加入3m L 0.004%DPPH·的甲醇溶液，搖勻，靜置30m in，517nm測吸光度。

式中:A樣品:加入樣品后反應(yīng)體系的吸光值;A對照:未加入樣品的DPPH·乙醇溶液的吸光值;A底:樣液本身在同等條件下的吸光度值。

1.2.6.3 銀杏外種皮總黃酮對超氧陰離子自由基清除能力的測定［8］所用溶液均用重蒸水配制:0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷－鹽酸(Tris－HCl)緩沖液(pH=8.2)，3mmol/L鄰苯三酚溶液。按照表1加入試劑，其中鄰苯三酚應(yīng)最后加入，加入后立即迅速混勻于320nm波長下進(jìn)行掃描，每隔30s記錄一次吸光值。

式中:S空白:鄰苯三酚的自氧化速率;S樣品:加入樣品的反應(yīng)體系氧化速率。

1.2.6.4 銀杏外種皮總黃酮對羥基自由基清除能力的測定 采用改進(jìn)的Fenton法［9］，4.0m L樣品溶液，加入1.2m L 20mmol/L水楊酸鈉，4.0m L 1.5mmol/L硫酸亞鐵溶液和2.8m L 6mmol/L過氧化氫，迅速混勻，37℃恒溫水浴1h。加入蒸餾水作為空白，510nm處測吸光值。

式中:A樣品:加入樣品后反應(yīng)體系的吸光值;A空白:加入蒸餾水的反應(yīng)體系的吸光值;A底:樣液本身在同等條件下的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀杏外種皮總黃酮提取的單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取溫度對銀杏外種皮總黃酮提取率的影響

稱取銀杏外種皮1.00g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液固比20∶1，提取時間2h，回流提取3次的條件下，考察提取溫度對提取率的影響。

由圖1可以看出，黃酮類化合物在乙醇中的溶解度隨著溫度的升高而增大，同時由于溫度升高，浸提液粘度減少，擴(kuò)散系數(shù)增加，促使浸提速度加快。從圖1還可以看出，黃酮提取率隨提取溫度的升高而增大，但超過70℃后，反而呈下降趨勢，因為黃酮在高溫下受熱易被氧化，且溫度過高時，熱能消耗大，提取液中的活性成分也易被破壞，雜質(zhì)的溶出量增加，給后續(xù)操作帶來不便，成本費用增大，綜合各方面因素考慮，浸提溫度以70℃左右為宜。

2.1.2 浸提時間對銀杏外種皮總黃酮提取的影響稱取銀杏外種皮1.00g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液固比20∶1，提取溫度70℃，回流提取3次的條件下，考察提取時間對提取率的影響。

圖1 提取溫度對總黃酮提取率的影響

從圖2可以看出，在最初的2h內(nèi)，銀杏黃酮提取率隨時間的延長而上升，當(dāng)達(dá)到2h后，提取率達(dá)90%。時間的延長對浸提效果影響不大，黃酮提取效果隨時間變化趨勢平緩，其原因可能是浸提液中黃酮濃度已基本與外種皮中黃酮濃度達(dá)到平衡。

圖2 浸提時間對總黃酮提取率的影響

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對銀杏外種皮總黃酮的影響稱取銀杏外種皮1.00g，在提取溫度70℃，提取時間2h，液固比20∶1，回流提取3次的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響。

由圖3可以看出，浸提溶劑的濃度會影響溶劑的極性，所以會對銀杏黃酮的溶解和浸提有一定的影響。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，增加乙醇含量使得總黃酮提取率上升，但在乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%后，反而不利于總黃酮的提取。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

2.1.4 液固比對銀杏外種皮總黃酮的影響 稱取銀杏外種皮1.00g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，提取時間2h，回流提取3次的條件下，考察液固比對提取率的影響。

銀杏外種皮提取率隨液固比的增大而增大，但在20∶1后增幅變慢，提取率隨液固比變化不太明顯，由于后續(xù)工作需濃縮，故而為節(jié)約時間考慮，選擇20∶1較適宜。

2.2 銀杏外種皮總黃酮最佳提取條件的確定

圖4 液固比對總黃酮提取率的影響

由表2可見，各因素作用的主次順序是:乙醇體積分?jǐn)?shù)＞溫度＞液固比＞浸提時間。乙醇體積分?jǐn)?shù)是主要因素，且隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，提取率提高，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，易將原料中的脂肪提出;其次是提取溫度，且高溫對黃酮的活性有一定影響，也可能是填充于細(xì)胞壁間的不溶性高分子非糖物質(zhì)變成可溶性膠體物質(zhì)而進(jìn)入提取液中［10］;再次是液固比，因為浸提液在后續(xù)工作中需要濃縮，若初期加水量過大會影響后續(xù)工序，使能耗增加，效率降低。綜合考慮，最終選取乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，溫度70℃，液固比25∶1，浸提時間2h，以此條件進(jìn)行提取，得提取率為91.01%。

表2 正交實驗結(jié)果

2.3 銀杏外種皮總黃酮抗氧化能力的測定結(jié)果

2.3.1 銀杏外種皮總黃酮的還原能力 如圖5所示，銀杏外種皮黃酮對三價鐵離子的還原能力隨其濃度上升而提高。當(dāng)黃酮濃度為 0.75mg/m L時，和0.1mg/m L的抗壞血酸的還原能力相當(dāng)，表明銀杏外種皮總黃酮具有較強(qiáng)的還原能力。

圖5 銀杏外種皮總黃酮的還原能力

2.3.2 銀杏外種皮總黃酮對自由基的清除能力 如圖6所示，銀杏外種皮總黃酮對DPPH·有明顯的抑制作用，其清除率在0～0.2mg/m L濃度范圍內(nèi)幾乎呈線性上升。當(dāng)溶液濃度大約0.6mg/m L時，清除率隨濃度增大而上升的趨勢緩慢，表明此時溶液中大部分的DPPH·均被清除。試樣在0～1.75mg/m L范圍內(nèi)隨濃度的增加，對超氧陰離子清除能力增強(qiáng)，直至濃度大于2mg/m L時，清除率變化緩慢，此時體系內(nèi)大部分·已被清除，表明它有良好的清除·的作用。同樣隨著樣液濃度的增加，對羥基自由基清除能力也隨之提高，變化趨勢與清除其他兩種自由基的變化趨勢相似。表明銀杏外種皮總黃酮中含有供氫體，具有提供氫質(zhì)子的能力，可使得具有高度氧化性的自由基還原，從而能終止自由基連鎖反應(yīng)，達(dá)到抑制甚至清除自由基的目的。

圖6 銀杏外種皮總黃酮對DPPH·、·和·OH的清除能力

從表3中可以看出，DPPH·的IC50最小，只有0.1654mg/m L;其次是·OH的，最后是·。這表明銀杏外種皮總黃酮樣品對自由基的清除能力大小排序為:DPPH·＞·OH＞O2－·。

表3 銀杏外種皮總黃酮清除DPPH·、·和·OH的半數(shù)抑制濃度

表3 銀杏外種皮總黃酮清除DPPH·、·和·OH的半數(shù)抑制濃度

自由基類型 回歸方程 相關(guān)系數(shù)(R2)IC50(mg/mL)DPPH· y=19.873Ln(x)+85.758 0.9791 0.1654 O－2· y=25.17Ln(x)+54.034 0.9322 0.8519·OH y=19.616Ln(x)+68.758 0.9855 0.3843

3 結(jié)論

經(jīng)單因素實驗及正交實驗，確定銀杏外種皮的較優(yōu)提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，溫度70℃，液固比25∶1，浸提時間2h，此時的提取率為91.01%。四個因素對提取效率影響大小排序為:乙醇體積分?jǐn)?shù)＞溫度＞液固比＞浸提時間。

銀杏外種皮總黃酮具有良好的抗氧化活性。通過還原力的比較實驗表明，總黃酮濃度為0.75mg/m L時與0.1mg/m L的抗壞血酸還原能力相當(dāng)，表明銀杏外種皮總黃酮具有較強(qiáng)的還原能力。對DPPH·、羥基自由基和超氧陰離子自由基三大體系的研究表明，銀杏外種皮總黃酮對DPPH·、·和·OH具有明顯的清除作用，且可得出量效關(guān)系。清除能力大小排序為:DPPH·＞·OH＞·。

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Extraction and antioxidant activities of total flavonoids from ginkgo biloba exocarp

LI Si－si，JIANG Bo*，ZHANG Tao，MU Wan－meng，MIAO ming

(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

Total flavonoids in ginkgo biloba exocarp were extracted with ethanol and analyzed for their antioxidant capacities.The effect of ethanol concentration，extraction time，liquid/material ratio and temperature were evaluated for optimizing the extraction procedure of total flavonoids.A maximum extraction rate of total flavonoids of 91.01%was obtained by 2h extraction using 80%ethanol at70℃ with a 25∶1 liquid/material ratio.The total flavonoids from ginkgo biloba exocarp had marked antioxidant activities:at the concentration of 0.75m g/m L，their reducing power was the same as 0.10mg/m L ascorbic acid;their scavenging effect on IC50of DPPH·，O2－· and·OH were 0.1654，0.8519，0.3843mg/m L.

ginkgo biloba exocarp;total flavonoids;extraction;antioxidant activities;free radicals

TS201.1

B

1002－0306(2011)08－0291－04

2010－07－14 *通訊聯(lián)系人

李思斯(1987－)，女，在讀碩士，研究方向:食品加工新技術(shù)原理及應(yīng)用。